Effects of Water and Nitrogen Interactions on Soil Nitrogen Composition and Bacterial Community in the Protected Vegetable Field
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摘要:
利用室内模拟培养试验，研究了不同水氮互作条件对设施菜田土壤氮素形态组成和细菌群落结构的影响。主因素为2种土壤水分条件：70%田间持水量和100%田间持水量；副因素为5种氮素添加形态：不施氮肥、纯无机氮、纯有机氮、2/3无机氮 + 1/3有机氮和1/3无机氮 + 2/3有机氮。结果表明：水氮互作效应对土壤无机氮含量和土壤细菌群落Shannon和Simpson指数的影响显著（P < 0.05）。高含水量条件下，土壤无机氮含量显著降低（P < 0.05），但土壤细菌群落的Shannon，Ace和Chao1指数极显著升高（P < 0.01），并且随着土壤含水量升高，Aeromonas和Flavobacterium菌属的相对丰度增加；培养30 d后，添加有机氮处理的土壤有机氮含量显著高于添加无机氮处理，添加有机氮使Cellvibrio和Devosia菌属相对丰度上升。可见，设施菜田施用有机氮肥尽管短期内不利于土壤速效氮的积累，但在适宜的水分条件下，土壤优势菌群发生了较大改变，部分固碳功能菌群丰度增加，有利于稳定土壤碳氮循环。试验结果为进一步研究设施菜田水氮管理介导的土壤碳氮循环功能菌群变化的环境驱动机制提供了一定科学依据。
Abstract:The interactions of water and nitrogen (N) on soil bacterial community were analyzed in a simulated indoor incubation experiment. The main factor included soil moisture (70% and 100% field capacity), and the split factor was N addition form (no N application, pure inorganic N, pure organic N, 2/3 inorganic N + 1/3 organic N, and 1/3 inorganic N + 2/3 organic N). The results showed that the interaction of water and nitrogen had significant influences on the content of soil inorganic N and the Shannon and Simpson indices of soil bacterial community. Moreover, the content of soil inorganic N in the high soil water treatment was significantly decreased (P < 0.05), while the Shannon, Ace and Chao1 indices of soil bacterial communities were significantly increased (P < 0.01). The relative abundances of Aeromonas and Flavobacterium were increased with the increase of soil moisture content. Compared to the inorganic N treatment, the organic N treatments significantly accelerated the content of soil organic N after 30 days of incubation. With the addition of organic N, the relative abundances of Cellvibrio and Devosia also increased. In conclusion, although organic N fertilization in the protected vegetable field could not be conducive to the increase of soil available N, the dominant bacterial populations changed under the appropriate water condition. Soil carbon-N cycle is supposed to tend toward stability with the increased richness of the specific carbon assimilating bacteria. The results may provide a new insight for understanding the environment-driven mechanisms for soil carbon and N cycling functional microbes, in response to the different water and N managements in the protected vegetable filed.
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设施农业是一种现代化集约型农业，具有需肥量高、蒸发量高、复种指数高和生长周期短等特点。设施土壤养分失衡和生态服务功能下降的问题已经成为国际性难题，也是当前我国设施农业可持续发展迫切需要解决的问题[1-2]。近年来，通过优化水肥管理等方式推动设施土壤生态质量提升的研究日趋增多。有关水肥管理对设施土壤微生物多样性的影响研究更是成为热点。已有研究表明不同水肥管理方式极大地影响着设施土壤的肥力特征和生态功能。大多数研究认为相比施用无机氮肥，施用有机肥能显著改善土壤微生物群落结构，提高细菌多样性[3-4]。Zhang等[5]发现施用有机肥后土壤硝化细菌丰度和多样性发生明显变化，并且这种变化和土壤pH的改变具有较强的相关性。Yang等[6]研究认为采用节水灌溉结合有机肥施用，可以有效提高土壤呼吸强度和固碳潜力，改善土壤细菌群落结构，稳定土壤生态系统。
在水氮互作效应方面，前人研究多数认为水氮交互效应显著影响设施土壤全氮、总有机碳、C/N和土壤酶活性，并且其对土壤氮素形态组成的影响主要体现在表层土壤中[7-8]。尽管水肥互作管理对土壤生态的重要性已得到广泛公认，但对水肥互作效应的认识还不够深入和重视，尤其是对微生物响应机制还不十分清楚。目前对设施菜田细菌群落结构和多样性的影响，大多只考虑水分和养分等单因素的影响，而忽略了因素间的相互作用效应。在土壤—植物—微生物系统中，土壤氮素形态组成直接影响着土壤微生物群落结构，微生物的群落结构变化又反过来调控着土壤氮素形态组成。微生物作为土壤关键元素生物地球化学循环作用的重要驱动者，在土壤有机质的分解、养分循环等过程中发挥着关键作用。土壤微生物群落多样性组成与土壤的生态服务功能密切相关。许多研究均表明，丰富而稳定的微生物种群结构可以有效提高设施菜地水肥利用效率，并最大程度地发挥土壤的生态功能[9-10]。细菌群落作为土壤环境中大量存在的微生物，在土壤碳氮循环过程中发挥着不可忽视的作用[11-12]。通过优化水氮互作因子，因地制宜地采用合理的水氮管理模式，是大幅度提高水、氮利用率和提高设施土壤生态功能的有效措施。虽然大量研究揭示了水氮条件在调节土壤碳氮循环和细菌群落多样性中的重要作用，但现有报道中有关土壤水分条件和氮素添加形态对土壤细菌群落多样性的影响及其与土壤氮素形态组成之间的关系研究相对较少。因此，本文采用裂区试验设计，借助Illumina MiSeq高通量测序平台，探讨不同水分条件和氮素添加形态对土壤细菌群落结构和多样性的变化及其与土壤氮素形态组成之间的关系，为深入阐明水氮互作影响设施菜田土壤氮素形态组成的微生态作用机制，提升设施菜田的水肥运筹水平和土壤生态质量提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验设计
2019年10月8日至11月6日在庄行农业综合试验站设施大棚内开展模拟培养试验。该试验站地处东经120°23′30′′，北纬30°54′16′′，属于亚热带海洋性季风气候，年平均气温16 ℃，年平均降水量为1074.2 mm。供试土壤类型为潴育水稻土，自2014年开始改水稻田为设施蔬菜大棚，已连续5年开展叶菜轮作栽培。采集设施大棚内0 ~ 20 cm土壤，风干后过2 mm筛备用。其基础理化性质为：全氮0.9 g kg−1，有机质12.5 g kg−1，速效氮112.9 mg kg−1，速效磷98.4 mg kg−1，速效钾210.2 mg kg−1，盐分0.1 g kg−1，pH 5.8。
采用二因素裂区试验设计，主因素为不同水分条件，W1为70%田间持水量（Field Capacity, FC）；W2为100%田间持水量。副因素为不同氮素形态（CK：不添加氮肥；IF：纯无机氮添加；OF：纯有机氮添加；IOF1：2/3无机氮 + 1/3有机氮；IOF2：1/3无机氮 + 2/3有机氮），共计10个处理，每个处理重复3次。试验用盆的下底长18.7 cm，上长22.7 cm，宽16.5 cm，高10 cm，化肥和牛粪秸秆均混匀施入土壤中。每盆装入1.3 kg的风干土，采用称重法加入定量蒸馏水。由于设施大棚内蒸发强度较大，为保持相对稳定的土壤湿度，调节土壤初始含水量为100% FC和70% FC，其对应的绝对含水量分别为300、210 g kg−1；然后将土壤置于设施大棚中敞口培养。每3 d用称重差减法补充去离子水，以保持土壤含水量的恒定。各氮肥添加处理控制等氮、等磷、等钾，其氮、磷、钾投入养分含量分别为100 mg kg−1、50 mg kg−1和100 mg kg−1。N肥为四水硝酸钙（N% = 11.9%），P肥为磷酸二氢钾（P% = 22.8%，K% = 28.7%），K肥为硫酸钾（K% = 44.8%）和磷酸二氢钾。有机氮按照牛粪（N 1.4%，P 0.2%，K 0.9%）和秸秆（N 0.9%，P 0.1%，K 0.5%）质量比1∶1混合配置而成。
1.2 测定方法
在培养30 d后，采集土壤样品，调查水氮互作对土壤氮库组成的影响，分析土壤细菌的群落结构变化。
土壤理化性质测定：土壤全氮含量采用开氏消煮法，有机碳采用重铬酸钾容量法，铵态氮采用靛酚蓝比色法测定，硝态氮采用酚二磺酸比色法测定[13]。土壤可溶性总氮含量采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[14]。根据测得的三种形态氮含量，计算土壤无机氮、有机氮、可溶性有机氮和难溶性有机氮含量：无机氮含量 = 铵态氮含量 + 硝态氮含量；有机氮含量 = 全氮含量 − （铵态氮含量 + 硝态氮含量）；可溶性有机氮含量 = 可溶性总氮 − 无机氮含量；难溶性有机氮含量 = 有机氮含量 − 可溶性有机氮含量[15]。
土壤微生物DNA提取和扩增：采用MoBio Power Soil DNA Isolation Kit (Carlsbad, USA)试剂盒提取土壤总DNA，提取过程按试剂盒说明书进行，土壤DNA样品于−20 ℃冰箱冻存。以细菌V3 ~ V4区特异引物（338F/806R）进行PCR扩增[16]。PCR扩增体系为5 × FastPfu Buffer 4 µl，dNTPs（2.5 mmol L−1）2 µl，Forward Primer(5 µmol L−1 ) 0.8 µl，Reverse Primer（5 µmol L−1）0.8 µl，FastPfu Polymerase 0.4 µl，BSA 0.2 µl，Template DNA 10 ng，ddH2O 20 µl。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；27个循环为95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s；然后72 ℃，延伸10 min（PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型）。
土壤细菌群落Illumina Miseq测序：使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluor TM -ST（Promega，USA）进行检测定量。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina公司）建库试剂盒进行文库构建，利用Illumina公司的Miseq PE 2*300平台进行测序（委托上海美吉生物医药科技有限公司）。
土壤细菌群落物种注释与丰度计算：原始测序序列使用Trimmomatic 0.33质控，使用FLASH 1.2.7进行拼接，使用UPARSE 7.1根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP Classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（http://www.arb-silva.de），设置比对阈值为70%，通过Mothur 1.39.5的最远邻接法聚类生成OUT（Operational taxonomic unit），相似性达到95%的归为同一个细菌属，构建稀释曲线，并分析每个细菌属在总细菌组成中的相对丰度[17]。利用QIIME 1.7.0计算土壤样本中包括Shannon指数、Simpson指数、ACE指数和Chao1指数的α多样性值。所测全部序列已提交至GenBank SRA（Sequence Read Archive），注册号为SRP190788。
1.3 数据处理
使用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0对试验数据整理分析；采用两因素裂区试验进行方差分析，并采用LSD最小显著差数法进行多重比较，分析水氮互作效应对土壤主要理化性状和α多样性指数的影响；对样本进行分组，组内采用T检验检测两组之间的指数值是否具有显著性差异。采用皮尔森系数检验土壤细菌α多样性与土壤不同形态氮素含量之间的相关性；利用R 3.5.1软件对细菌群落β-多样性进行NMDS（Non-metric Multidimensional scaling非度量多维尺度分析）组间比较[18]，绘制细菌群落结构的Heatmap图，并利用其Hierarchical-cluster函数进行样本和物种聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 水氮互作对设施菜田土壤氮素形态组成的影响
土壤主要理化性状的方差分析表明，不同水分条件和氮素添加形态均对设施菜田土壤主要理化性状影响显著（表1）。主处理土壤水分对土壤全氮含量、有机碳含量、pH值、土壤有机氮含量无显著影响（P > 0.05），但对土壤无机氮含量有显著影响（P < 0.05）。副处理氮素添加形态除对土壤全氮含量无显著影响外（P > 0.05），对土壤有机碳含量、pH值以及土壤无机氮和有机氮含量均有显著影响（P < 0.05）。各处理区组内无显著性差异。从水氮互作效应来看，水氮互作对土壤无机氮含量（NIN和AMN）的影响达到极显著水平（P < 0.01），对土壤有机碳含量、pH值和有机氮含量的影响差异未达到显著水平。
表 1 不同水氮处理设施菜田土壤主要理化性状方差分析Table 1. Variance analysis for the main soil physicochemical properties in the protected vegetable field with different nitrogen and soil moisture treatments变异来源
Source of variation全氮
Total nitrogen有机碳
Organic carbonpH 无机氮 Inorganic nitrogen 有机氮 Organic nitrogen NIN AMN SON ION 主处理（W） ns ns ns * ** ns ns 副处理（F） ns ** ** ** ** ** ** 区组（n） ns ns ns ns ns ns ns 主 × 副（W × F） ns ns ns ** ** ns ns 注：NIN: NO3−-N含量，AMN：NH4+-N含量，SON：可溶性有机氮含量，ION：难溶性有机氮含量。ns表示无显著性差异，*显著水平为P < 0. 05，**显著水平为P < 0. 01，下同 表2显示了设施菜田土壤在不同水分条件和氮素添加形态对土壤主要理化性状的影响。在高土壤水分条件下，土壤有机碳含量和pH值整体高于低土壤水分条件，但差异未达到显著水平（P < 0.05）。同一土壤水分条件下，不同配比牛粪秸秆有机氮添加处理土壤中有机碳含量均显著高于不添加氮肥和纯无机氮添加处理（P < 0.05）。从土壤中氮素形态组成来看，设施菜田土壤不同形态氮素组成中ION比例最高，占85% ~ 95%，SON和AMN占比次之，NIN占比最低。从土壤无机氮组成来看，设施菜田土壤在不同水分条件和氮素添加形态下AMN含量高于NIN含量。不同水分条件下，纯无机氮添加处理（IF）土壤中NIN含量和AMN含量均高于纯有机氮添加处理（OF）。IFW1水氮互作条件下，土壤中NIN含量和AMN含量均显著高于其他处理（P < 0.05）。IFW1水氮互作条件下，土壤中SON含量也最高，但差异未达到显著水平（P > 0.05）。
表 2 不同水氮处理设施菜田土壤的主要理化性状Table 2. The main physicochemical properties of soil in the protected vegetable field with different nitrogen and soil moisture treatments处理
Treatment全氮
Total nitrogen
（g kg−1）有机碳
Organic carbon
（g kg−1）pH 无机氮
Inorganic nitrogen有机氮
Organic nitrogenNIN
（mg kg−1）AMN
（mg kg−1）SON
（mg kg−1）ION
（g kg−1）W1 CK 0.91 a 5.82 d 6.88 bc 26.41 bc 41.26 b 49.52 ab 0.79 bc IF 0.93 a 5.59 d 6.85 c 40.11 a 47.59 a 73.12 a 0.77 c OF 1.00 a 8.84 a 6.96 abc 22.88 cd 40.16 b 20.08 bcd 0.92 ab IOF1 1.02 a 7.87 ab 6.94 abc 32.52 b 39.14 b 66.99 a 0.88 abc IOF2 0.99 a 7.58 abc 6.96 abc 25.82 bc 41.42 b 42.46 abc 0.88 abc W2 CK 0.93 a 7.00 bcd 7.05 abc 17.59 de 38.73 b 44.53 abc 0.83 abc IF 0.91 a 6.09 cd 7.01 abc 31.65 b 40.02 b 67.35 a 0.77 c OF 1.01 a 8.74 a 7.09 ab 26.05 bc 29.23 c 8.26 d 0.95 a IOF1 0.96 a 7.73 abc 7.09 ab 16.47 de 40.28 b 16.5 bcd 0.89 abc IOF2 0.96 a 8.12 ab 7.15 a 15.05 e 27.81 c 9.38 cd 0.91 abc 注：多重比较采用LSD法，同列不同字母表示处理间差异显著（P < 0.05） 2.2 水氮互作对设施菜田土壤细菌菌群丰度和β多样性的影响
基于Bray-Curtis距离，在OTU水平的NMDS分析揭示了水分条件和氮素形态添加对土壤样本细菌群落之间的相似性（图1）。不同颜色或形状的点代表不同分组的样本，两样本点越接近，表明两样本物种组成越相似。横纵坐标表示相对距离。结果表明在不同水分条件下，土壤样本细菌群落结构之间，未发生显著分离（图1a）；但在不同氮素添加形态下，细菌群落结构分离显著（图1b），特别是添加有机氮的土壤样本与不施氮肥和纯无机氮添加的细菌群落结构之间的差异最为显著，表明氮素添加形态对土壤细菌群落结构组成的影响较大。
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图 1 设施菜田土壤细菌群落结构的NMDS分析(a:不同水分条件; b:不同土壤氮素添加形态)Figure 1. Analysis of soil bacterial community composition by non-metric multi-dimensional scaling (a: water gradient; b: nitrogen form)图2显示了不同水分条件和氮素添加形态对设施菜田土壤细菌群落结构组成差异的影响。横坐标为分组名，纵坐标为物种名，通过色块颜色梯度来展示样本中不同物种的丰度变化情况，图中颜色梯度数值为物种丰度的对数值。
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图 2 不同水氮处理下设施菜田土壤细菌群落结构属水平组成差异（a: 不同水分条件; b: 不同土壤氮素添加形态）Figure 2. The discrepancy of soil bacterial community structure at genus level under different soil moisture gradients and nitrogen addition forms (a: water gradient; b: nitrogen form)土壤含水量高低对细菌群落优势属的影响较大（图2a）。W1处理中细菌群落相对丰度值大于0.05的优势属为Pontibacter（0.272），Devosia（0.091），Flavobacterium（0.064），Cellvibrio（0.056），Herpetosiphon（0.056），Thiobacillus（0.054），Brevundimonas（0.053）；W2处理中细菌群落相对丰度大于0.05的优势属为Pontibacter（0.206），Flavobacterium（0.114），Devosia（0.101），Thiobacillus（0.069），Cellvibrio（0.068），Aeromonas（0.061）。相比低含水量处理，高含水量处理土壤中Aeromonas和Flavobacterium优势菌属的相对丰度分别增加了208.1%和78.1%。此外，不同氮素添加形态也显著影响着设施菜田土壤的细菌群落优势属组成（图2b）。通过聚类分析可以看出，不施氮肥和纯无机氮添加处理的土壤中细菌群落组成与添加有机氮处理的具有显著差异。CK和IF处理土壤中细菌群落相对丰度均大于0.05的优势属为Pontibacter，Thiobacillus和Flavobacterium；OF，IOF1和IOF2处理土壤中细菌群落相对丰度均大于0.05的优势属为Pontibacter，Cellvibrio，Devosia，Flavobacterium，Herpetosiphon。相比纯无机氮添加处理，有机氮添加处理的Cellvibrio和Devosia菌属的相对丰度明显增加，但Thiobacillus菌属的相对丰度出现了大幅降低。
2.3 水氮互作对设施菜田土壤细菌α多样性指数的影响
通过Miseq高通量测序质量控制后得到优质序列1639889条，按照最小样本序列数抽平均一化处理后单个样本序列数为27310条，序列平均长度422.8 bp。
α多样性指数主要用以测度群落内的物种多样性。Shannon、Simpson、Ace和Chao1指数是最为常用的α多样性度量指标。其中，Ace和Chao1指数反映土壤样品中细菌群落的丰富度，指数越大，代表物种总数越多；Shannon和Simpson指数反映土壤样品中细菌群落的多样性，Shannon指数越大、Simpson指数越小，代表群落多样性越高。从表3两因素裂区试验方差分析结果可以看出，主处理土壤水分对土壤细菌Shannon、Ace和Chao1指数有显著影响，副处理氮素添加形态对土壤细菌Shannon、Simpson和Chao1指数有显著影响，区组内无显著性差异。水氮互作效应对土壤细菌群落Shannon和Simpson指数有极显著影响（P < 0.01），但对Ace和Chao1指数的影响不显著。
表 3 不同水氮处理设施菜田土壤细菌α多样性指数的方差分析Table 3. Variance analysis about the α diversity indices of soil bacterial community in the protected vegetable field with different nitrogen and soil moisture treatments变异来源
Source of variationShannon Simpson Ace Chao1 F 显著性 F 显著性 F 显著性 F 显著性 主处理（W） 18.66 * 9.31 ns 57.61 * 158.97 ** 副处理（F） 3.85 * 9.05 ** 1.84 ns 4.27 * 区组（n） 0.29 ns 1.00 ns 0.17 ns 1.34 ns 主 × 副（W × F） 11.41 ** 11.09 ** 1.53 ns 2.69 ns 为了进一步明确水分条件和氮素添加形态对设施土壤细菌群落多样性影响的组内效应，对土壤样本进行了分组，分析了不同分组条件对土壤细菌α多样性指数变化的影响。从图3中可见，水分条件处理对土壤细菌群落的Shannon、Simpson、Ace和Chao1指数均具有显著差异（P < 0.01）。W2处理的Shannon、Ace和Chao1指数高于W1处理，Simpson指数则相反。不同氮素添加形态处理对土壤细菌群落Simpson和Chao1指数的影响效应也达到显著以上水平（P < 0.01），与IF处理相比，OF处理显著降低了Chao1指数（P < 0.01）。
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图 3 不同土壤水分含量和氮素添加形态对设施菜田土壤细菌群落的α多样性指数的影响图中，0.01 < P < 0.05标记为*，0.001 < P < 0.01标记为**，P < 0.001标记为***。横坐标为分组名，纵坐标为每组的指数平均值。a: Shannon指数；b:Simpson指数；c: Ace指数; d: Chao1指数。组内差异比较采用T检验Figure 3. Changes in the α diversity indices of soil bacterial community under different soil moisture gradients and nitrogen addition forms2.4 水氮互作下设施菜田土壤氮素形态组成与细菌多样性指数的相关性
土壤细菌α多样性与土壤不同形态氮素的相关性分析结果见表4。从土壤不同氮库组成之间的相关关系来看，NIN含量与SON含量呈显著正相关关系（P < 0.05），AMN与SON呈显著正相关关系（P < 0.05），与ION呈显著负相关关系（P < 0.05），SON与ION呈极显著负相关关系（P < 0.01）；从土壤细菌α多样性指数与不同氮库组成的相关关系来看，Simpson指数与NIN呈显著正相关关系（P < 0.05）；从土壤细菌α多样性指数之间的相关关系来看，Shannon指数与其他多样性指数之间的相关性均达到显著水平。表明土壤不同氮库组成中，NIN含量对土壤α多样性指数的影响最大。
表 4 土壤氮素形态组成与细菌多样性指数的皮尔森相关性Table 4. Pearson correlation between bacterial α diversity indices and nitrogen composition因子 Factor NIN AMN SON ION Shannon Simpson Ace Chao1 NIN 1 AMN 0.564 1 SON 0.751* 0.734* 1 ION −0.531 −0.673* −0.829** 1 Shannon −0.588 −0.519 −0.341 0.387 1 Simpson 0.661* 0.595 0.452 −0.555 −0.929** 1 Ace −0.357 −0.353 −0.148 0.021 0.779** −0.614 1 Chao1 −0.306 −0.398 −0.131 −0.097 0.675* −0.465 0.956** 1 注：*为0.05显著，R0.05 = 0.632；**为0.01显著R0.01 = 0.765。 3. 讨论
3.1 设施菜田土壤氮素形态组成对水氮互作响应的综合分析
土壤氮素形态组成的变化能够直观反映有机氮的矿化过程和各组分之间的转化规律以及土壤的供氮能力。土壤中氮素的转化是一个错综复杂的过程，土壤氮素形态组成是各个过程综合作用的结果。土壤中的氮素主要以有机形态存在，一般表土中无机氮只占全氮的1% ~ 2%[14]。土壤NIN和AMN作为无机氮可以直接被植物吸收利用。SON是土壤有机氮的重要组成部分，在土壤氮素转化和氮素的植物吸收中扮演重要角色。通常情况下土壤中SON含量和无机氮库数量相当。SON可以直接或经过转化后被作物吸收利用，它的移动性相对较强，可随水分运移而发生径流或淋溶损失。SON主要包括低相对分子质量的有机酸和氨基酸，以及极少量高相对分子质量的富啡酸和胡敏酸等。
前人研究表明土壤NIN含量会随着土壤含水量增加而降低[19]，施用化肥能显著增加土壤中的NIN和AMN，但配施有机肥后对土壤氮素形态组成的影响相对复杂，不仅与有机肥配施比例和用量有关，还与土壤水分和施用周期等因素密切相关[20]，特别是水氮互作效应对土壤氮素形态组成的影响值得深入关注。本研究中，高土壤含水量条件下土壤有效氮组分（NIN，AMN和SON）下降（表1），水氮互作对土壤无机氮含量（NIN和AMN）的影响达到极显著水平（P < 0.01）。本试验结果还显示单施化肥氮显著增加了土壤中无机氮和SON的含量，对氮库有效组分产生了正激发效应，但配施有机氮肥与单施化肥氮相比，并没有增加土壤中的有效氮源。原因可能是本研究在设施菜田土壤养分供给充足的情况下，外源添加的有机氮素许多直接被土壤微生物吸收利用，因此配施有机氮肥在短时间内没有出现明显的土壤氮素正激发效应。但随着培养时间的延长，微生物代谢产物会逐步将自身固定的大量氮素释放出来，以满足土壤—微生物—作物的养分平衡需求。这种养分释放调控机制将土壤—微生物系统作为养分周转储存库，在提高土壤有机氮矿化潜力的同时，减少了养分向环境中迁移的损失，降低了环境污染风险。
3.2 设施菜田土壤细菌群落结构对水氮互作响应的综合分析
3.2.1 设施菜田土壤细菌α多样性对水氮互作的响应
土壤微生物群落多样性指数是表征土壤微生物群落丰富度和均匀度的综合指标，ACE、Chao1和Shannon指数越高、Simpson指数越低，则表明土壤微生物群落丰富度和均匀度越高。土壤细菌是土壤微生物中种类最多、数量最大、功能最丰富的类群，是驱动地球生物化学循环，维持生态系统物质循环和能量流动的关键环节[11]。土壤细菌群落结构影响着土壤肥力，对土壤生态系统有重要作用，其多样性及丰度与环境因素息息相关[21]。土壤含水量的改变会通过影响土壤营养物质运输、底物可用性和土壤其他特性，而对土壤细菌多样性产生影响[22]。除了水分条件外，施肥对土壤细菌群落结构也存在较大影响。外源氮肥主要通过影响地下部土壤环境条件以及地上部植物群落组成从而调节土壤细菌的生长[23]。本研究中水氮互作效应对土壤细菌群落Shannon和Simpson指数均有极显著影响（表3），土壤激发效应表现明显。土壤激发效应理论认为外源添加物、土壤微生物和土壤三者相互作用导致了激发效应的产生，而微生物的活动是决定土壤激发效应的关键，其激发效应的具体表现与不同水氮管理条件所引起的微生物活性、数量和组成的改变密切有关[24]。此外，本研究发现高土壤含水量显著增加了细菌群落的ACE、Chao1和Shannon指数（图4），原因可能是由于土壤含水量增加后，在一定的范围内，使氮、磷、钾等无机元素和有机质等可利用性增加，为更多的微生物提供了生长和繁殖的条件，因此细菌的群落多样性增加，这与杨亚东等人[25]的研究结果一致。本研究中与纯无机氮添加相比，纯有机氮添加显著降低了Chao1指数。Chao1和Ace是用来计算菌群丰度的多样性指数，在生态学中常被用来估计物种总数。刘佳等[26]对长期施肥后旱地红壤细菌群落变化的研究表明，长期施用化学氮肥造成红壤酸化的负面效应远超肥力改善的正面效应，但化学氮磷钾配施有机肥能显著增加土壤细菌群落的多样性指数。本研究中尽管不同氮素添加形态对Shannon指数无显著影响（P > 0.05），但纯有机氮添加处理的Chao1指数和ACE指数均出现降低趋势。造成研究结果差异的原因，可能是本试验有机氮的添加激发了土壤线虫和原生动物等捕食者的摄食行为[27~28]，间接造成了短期试验过程中微域内土壤细菌群落丰度的下降。
3.2.2 设施菜田土壤细菌群落优势菌群对水氮互作的响应
土壤微生物活性及群落结构变化可敏感地反映土壤生态系统的质量和健康状况。本研究中随着含水量升高，土壤中Aeromonas和Flavobacterium优势菌属的相对丰度分别增加了208.1%和78.1%（图3a）。从分类地位上看，Aeromonas属于变形菌门气单孢菌属，Flavobacterium属于拟杆菌门黄杆菌属，两者都为反硝化细菌主要类群，与土壤含水量呈显著正相关关系[29]。相比无机氮处理，有机氮添加处理的Cellvibrio和Devosia菌属的相对丰度明显增加，但Thiobacillus菌属的相对丰度大幅降低（图3b）。Cellvibrio和Devosia隶属于变形菌门纤维弧菌属和德沃斯氏菌属，多存在于腐殖质环境中[30]，具有降解纤维素和较强环境耐受性等功能。随着有机氮施入，土壤中Cellvibrio和Devosia菌属的相对丰度增加，以加快对难降解有机物的代谢分解。Thiobacillus隶属于变形菌门硫杆菌属，嗜好酸性和偏中性生长环境，对稳定土壤碳循环具有重要作用。本研究中有机氮的施入使土壤中Thiobacillus菌属的相对丰度减少（图3b），这可能与有机肥的加入造成土壤pH等生境的变化相关。水氮互作主要通过土壤激发效应改变了土壤养分含量、肥力特征以及微生物活性，进而引发原位土壤有机碳/氮的周转变化，从而决定了土壤细菌的群落结构特征[24]。
事实上，土壤化学性质包括土壤含水量、pH和无机氮含量等都是影响土壤细菌群落结构的主要土壤环境因素[31-32]。它们通过改变土壤细菌可获取的营养物质和所处的环境，从而调节土壤中适宜生长的细菌群落结构。例如外源化肥氮添加会使肥料中的NH4+在氧化成亚硝酸盐过程中释放出H+，引起土壤酸化，从而使不耐酸细菌物种繁殖缓慢，造成细菌物种多样性的改变[33]。本研究中通过对不同水氮条件下土壤细菌群落结构与土壤氮素形态组成的关联性分析，得出细菌优势菌群的相对丰度变化主要受到氮素营养有效性的驱动（表2），特别是土壤中的NIN含量显著影响着土壤细菌群落的丰富度和均匀度（P < 0.05）。土壤中可利用性氮素含量的改变，直接影响了喜氮微生物的群落丰度和多样性，从而导致土壤细菌丰度和优势菌群的改变。实际上，水氮互作方式对土壤细菌群落组成和结构存在诸多复杂影响。本研究只分析了土壤细菌群落的整体变化，并未对氮代谢功能类群的微生物进行研究。由于这些特殊功能类群的微生物参与的土壤氮代谢途径及功能的差异，不同水氮互作管理条件引起的细菌群落结构差异是否会导致土壤肥力、健康状况和生态系统功能变化尚有待进一步研究。
4. 结论
（1）水氮互作管理条件对设施菜田土壤氮素形态组成和土壤细菌群落结构均有显著影响。水氮互作效应对土壤无机氮含量和土壤细菌群落Shannon和Simpson指数的影响显著。
（2）高土壤含水量显著降低了土壤无机氮含量。施用有机氮肥，短期内尽管不利于土壤速效氮素的增加，但在适宜水分条件下，土壤优势菌群改变，部分固碳功能菌群丰度增加，有利于稳定土壤碳氮循环，促进土壤正激发效应。
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图 1 设施菜田土壤细菌群落结构的NMDS分析(a:不同水分条件; b:不同土壤氮素添加形态)
Figure 1. Analysis of soil bacterial community composition by non-metric multi-dimensional scaling (a: water gradient; b: nitrogen form)
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图 2 不同水氮处理下设施菜田土壤细菌群落结构属水平组成差异（a: 不同水分条件; b: 不同土壤氮素添加形态）
Figure 2. The discrepancy of soil bacterial community structure at genus level under different soil moisture gradients and nitrogen addition forms (a: water gradient; b: nitrogen form)
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图 3 不同土壤水分含量和氮素添加形态对设施菜田土壤细菌群落的α多样性指数的影响
图中，0.01 < P < 0.05标记为*，0.001 < P < 0.01标记为**，P < 0.001标记为***。横坐标为分组名，纵坐标为每组的指数平均值。a: Shannon指数；b:Simpson指数；c: Ace指数; d: Chao1指数。组内差异比较采用T检验
Figure 3. Changes in the α diversity indices of soil bacterial community under different soil moisture gradients and nitrogen addition forms
表 1 不同水氮处理设施菜田土壤主要理化性状方差分析
Table 1 Variance analysis for the main soil physicochemical properties in the protected vegetable field with different nitrogen and soil moisture treatments
变异来源
Source of variation全氮
Total nitrogen有机碳
Organic carbonpH 无机氮 Inorganic nitrogen 有机氮 Organic nitrogen NIN AMN SON ION 主处理（W） ns ns ns * ** ns ns 副处理（F） ns ** ** ** ** ** ** 区组（n） ns ns ns ns ns ns ns 主 × 副（W × F） ns ns ns ** ** ns ns 注：NIN: NO3−-N含量，AMN：NH4+-N含量，SON：可溶性有机氮含量，ION：难溶性有机氮含量。ns表示无显著性差异，*显著水平为P < 0. 05，**显著水平为P < 0. 01，下同 
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表 2 不同水氮处理设施菜田土壤的主要理化性状
Table 2 The main physicochemical properties of soil in the protected vegetable field with different nitrogen and soil moisture treatments
处理
Treatment全氮
Total nitrogen
（g kg−1）有机碳
Organic carbon
（g kg−1）pH 无机氮
Inorganic nitrogen有机氮
Organic nitrogenNIN
（mg kg−1）AMN
（mg kg−1）SON
（mg kg−1）ION
（g kg−1）W1 CK 0.91 a 5.82 d 6.88 bc 26.41 bc 41.26 b 49.52 ab 0.79 bc IF 0.93 a 5.59 d 6.85 c 40.11 a 47.59 a 73.12 a 0.77 c OF 1.00 a 8.84 a 6.96 abc 22.88 cd 40.16 b 20.08 bcd 0.92 ab IOF1 1.02 a 7.87 ab 6.94 abc 32.52 b 39.14 b 66.99 a 0.88 abc IOF2 0.99 a 7.58 abc 6.96 abc 25.82 bc 41.42 b 42.46 abc 0.88 abc W2 CK 0.93 a 7.00 bcd 7.05 abc 17.59 de 38.73 b 44.53 abc 0.83 abc IF 0.91 a 6.09 cd 7.01 abc 31.65 b 40.02 b 67.35 a 0.77 c OF 1.01 a 8.74 a 7.09 ab 26.05 bc 29.23 c 8.26 d 0.95 a IOF1 0.96 a 7.73 abc 7.09 ab 16.47 de 40.28 b 16.5 bcd 0.89 abc IOF2 0.96 a 8.12 ab 7.15 a 15.05 e 27.81 c 9.38 cd 0.91 abc 注：多重比较采用LSD法，同列不同字母表示处理间差异显著（P < 0.05）
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表 3 不同水氮处理设施菜田土壤细菌α多样性指数的方差分析
Table 3 Variance analysis about the α diversity indices of soil bacterial community in the protected vegetable field with different nitrogen and soil moisture treatments
变异来源
Source of variationShannon Simpson Ace Chao1 F 显著性 F 显著性 F 显著性 F 显著性 主处理（W） 18.66 * 9.31 ns 57.61 * 158.97 ** 副处理（F） 3.85 * 9.05 ** 1.84 ns 4.27 * 区组（n） 0.29 ns 1.00 ns 0.17 ns 1.34 ns 主 × 副（W × F） 11.41 ** 11.09 ** 1.53 ns 2.69 ns
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表 4 土壤氮素形态组成与细菌多样性指数的皮尔森相关性
Table 4 Pearson correlation between bacterial α diversity indices and nitrogen composition
因子 Factor NIN AMN SON ION Shannon Simpson Ace Chao1 NIN 1 AMN 0.564 1 SON 0.751* 0.734* 1 ION −0.531 −0.673* −0.829** 1 Shannon −0.588 −0.519 −0.341 0.387 1 Simpson 0.661* 0.595 0.452 −0.555 −0.929** 1 Ace −0.357 −0.353 −0.148 0.021 0.779** −0.614 1 Chao1 −0.306 −0.398 −0.131 −0.097 0.675* −0.465 0.956** 1 注：*为0.05显著，R0.05 = 0.632；**为0.01显著R0.01 = 0.765。
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