Effects of Combined Addition of Biochemical Inhibitors and Humic Acids on Nitrogen Supply by Stability Urea for Rice in Black Soil
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摘要:目的 研究同时添加不同种生化抑制剂和腐植酸后尿素在黑土区水田的施用效果，为黑土区稻田新一代高效稳定性尿素肥料的研制提供理论依据。方法 采用盆栽方法，以不施氮肥（CK）及施用尿素（N）为对照，通过测定水稻土中的氮素转化特征及水稻生理指标、产量及氮肥利用效率等的影响，探究添加腐植酸（HA）、N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）、3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）和2-氯-6-三甲基吡啶（CP）及腐植酸分别与三种生化抑制剂组合制成的7种稳定性尿素肥料改善氮素供应稳定性的差异。结果 ①相比单施普通尿素，添加腐植酸及NBPT、DMPP、CP均能提高水稻产量、吸氮量及尿素氮肥利用效率。② 相比单独施用NBPT，尿素联合添加NBPT和腐植酸后能有效抑制土壤硝化作用，分别提高水稻株高、分蘖数和叶绿素含量1.84%、13.38%和2.80%，但会降低水稻产量、叶面积指数、水稻吸氮量、氮肥利用率及偏生产力。③ 相比单独施用DMPP，尿素联合添加腐植酸、DMPP能分别提高水稻株高、分蘖数和叶绿素含量3.04%、5.20%和3.71%，显著降低土壤硝化抑制率、水稻产量、水稻吸氮量、氮肥利用率及偏生产力（P < 0.05）。④ 相比单独施用CP，尿素联合添加腐植酸、CP提高了土壤速效氮含量、水稻株高、分蘖数、叶绿素含量、生物产量，显著提高水稻籽粒产量、水稻吸氮量、氮肥利用率及偏生产力（P < 0.05）。结论 腐植酸与CP联合添加制成新型稳定尿素肥料用于在东北黑土区水稻栽培，有利于作物增产及氮肥利用率的提高。Abstract:Objective The application effects of stability urea adding different biochemical inhibitors and humic acids were carried on rice planted in black soil, in order to provide a theoretical basis for the development of a new generation of high efficiency and stability urea for rice planted in black soils.Method In the pot experiment, blank (CK) and urea (N) were set as controls, through the determination nitrogen transformation characteristics of paddy soil, rice physiological indices, yield and nitrogen fertilizer use efficiencies, to investigate the differences in nitrogen supply stability of 7 kinds of stability urea made from humic acids (HA), N-butyl thiophosphate-triamine (NBPT), 3,4-Dimethylpyrazole phosphate (DMPP), 2-chloro-6-trimethyl-pyridine (CP) and humic acids with 3 biochemical inhibitors, respectively.Result ① Urea (N) was set as controls, adding humic acids, NBPT, DMPP and CP could increase rice yield, N uptake and nitrogen use efficiency. ② Compared with the application of NBPT alone, the addition of humic acids could effectively inhibit soil nitrification, plant height, tiller number and chlorophyll contents of rice were increased by 1.84%, 13.38% and 2.80%, but yield, leaf area, nitrogen uptake, NUE and NPFP of rice were decreased. ③ Compared with the application of DMPP alone, the addition of humic acids could increase plant height, tiller number and chlorophyll contents of rice by 3.04%, 5.20% and 3.71%, respectively. And it also could significantly decrease nitrification inhibition rate, rice yield, nitrogen uptake, NUE and NPFP (P < 0.05). ④ Compared with the application of CP alone, the addition of humic acids increased soil available nitrogen content, plant height, tiller number, chlorophyll contents and total biomass of rice, significantly increased grain yield, nitrogen uptake, NUE and NPFP（P < 0.05）.Conclusion Adding humic acids and CP to urea to make a new type of stability urea for rice cultivation in the black soil area of northeast China is beneficial to the increase of crop yield and the improvement of nitrogen use efficiency.
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Keywords:
- Rice /
- Biostimulant /
- Urease inhibitor /
- Nitrification inhibitor /
- Ammonium nitrogen /
- Nitrate nitrogen /
- Nitrogen use efficiency
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【研究意义】水稻是世界一半以上人口的粮食作物，中国有四分之一的耕地被用来种植水稻，超过一半的人以大米为主要粮食[1]。前人研究发现，氮作为植物生长必需的大量营养元素，氮肥的施入能有效提高水稻产量，对水稻长势及品质具有重要影响[2-3]。然而近年来，水稻栽培过程中氮肥用量过大，利用率低[4]问题引起人们的广泛关注。尿素是我国水稻种植中常用的氮素肥料[5]，在施入土壤后会迅速水解，通过氨挥发，反硝化及淋溶等方式损失，仅有不足一半的氮肥会被植物吸收利用[6]，造成氮肥利用率低的问题。氮素利用率低下往往会导致相当一部分进入到水体及大气环境中[7]，造成水体营养化，温室效应等问题[8]。为解决这类问题，我国大力推动新型肥料研发工作，以减轻由于氮肥利用率低导致的一系列问题。
【前人研究进展】稳定性肥料作为有着良好环境效益及农学效益的一类新型肥料，核心是脲酶抑制剂及硝化抑制剂[9]，已被证实具有提高粮食产量，提高氮肥利用率，减少氮氧化物排放[10-12]等作用，已经在我国多个地区推广使用，并取得良好效果[13]。然而生化抑制剂的有效性受多种土壤因素的影响[14-15]，不同种类生化抑制剂对不同种类型土壤和作物作用效果差异很大，因此开发最适宜特定土壤和作物的高效专用稳定性尿素肥料，提高普通稳定性尿素肥料的施用效果，是未来稳定性尿素肥料的发展趋势。
生物刺激素对植物生长作用显著，目前生物刺激素正在广泛应用于农业生产的各个领域。近年来，在中国生物刺激素产业发展很快，2016年，中国生物刺激素发展联盟（CBDA）成立，标志着生物刺激素已经在我国已经得到广泛认可并被大量应用，2021年举办的第五届农用生物刺激剂应用峰会中，生物刺激剂被重新定义划分为六类，分别是腐植酸、氨基酸类、海藻提取物、甲壳素及其衍生物、微生物及代谢物、植物提取物，其中腐植酸在当前农业生产中的应用较多，范围较广。
【本研究切入点】腐植酸是土壤中死亡生物通过化学及微生物降解形成的一类有机物[16]，已经被证实对植物生长具有重要作用[17-18]。当前腐植酸在我国农业中以水溶肥、叶面肥等形式被大量应用。同时研究证实，腐植酸肥料具有提升果实品质[19]、增强土壤微生物活性[20]、提高肥料利用率及增加农产品产量[21]等效果。但对于腐植酸与稳定性肥料技术结合研发新型高效稳定性尿素肥料及其施用效果报道较少，腐植酸与生化抑制剂结合研制稳定性增效尿素肥料的效果如何还未有明确结论，因此对于二者结合的作用效果值得探究。【拟解决的问题】本试验研究在黑土上的水稻种植过程中，腐植酸与不同种生化抑制剂结合添加到尿素中制成的稳定性增效尿素肥料的施用效果，为提高我国黑土水田氮肥利用率，研制用于黑土稻田的高效稳定性增效尿素肥料提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
供试土壤为黑土，采自吉林省农安县永安乡0 ~ 20 cm耕层。土壤有机质为32.19 g kg−1，全氮1.68 g kg−1，铵态氮11.15 mg kg−1，硝态氮59.73 mg kg−1，全磷0.79 g kg−1，速效磷78.88 mg kg−1，全钾50.50 g kg−1，速效钾322.15 mg kg−1，pH值6.23。供试肥料氮肥为尿素，N含量46%；磷肥为重过磷酸钙，P2O5含量43%；钾肥为氯化钾，K2O含量60%。脲酶抑制剂N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）、硝化抑制剂3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）、2-氯-6-三甲基吡啶（CP）三种生化抑制剂均为分析纯。所用腐植酸（Humic acids，HA），腐植酸含量70%。供试作物为粳稻，品种为美锋1号。
1.2 试验设计
试验设9个处理，各处理均添加等量磷钾肥料：① 不施氮肥（CK）；② 氮肥（N）；③ 氮肥 + HA（H）；④ 氮肥 + NBPT（NBPT）；⑤ 氮肥 + DMPP（DMPP）；⑥ 氮肥 + CP（CP）；⑦ 氮肥 + NBPT + HA（NBPT + H）；⑧ 氮肥 + DMPP + HA（DMPP + H）；⑨ 氮肥 + CP + HA（CP + H）。上述各施氮处理施氮量均为0.7 g kg−1干土，施磷量0.12 g P2O5 kg−1干土，施钾量0.15 g K2O kg−1干土。NBPT、DMPP、CP和腐植酸添加量分别为尿素用量的0.25%、0.5%、0.25%和6‰。试验采用水稻盆栽方法进行，每盆装风干土6 kg，每盆定植5穴水稻，每穴3株。每处理3次重复。
具体盆栽方法：将经过预处理的土壤平铺在塑料布上，将提前称重好的生化抑制剂与生物刺激素混合均匀，再与尿素肥料混合均匀，制成高效稳定性增效尿素肥料，均匀地与土壤混合，将混合后的土壤转移至高28 cm，直径26 cm的塑料盆中。水稻的生育过程中人工浇水，保证浇水量一致，按照当地田间常规操作进行田间管理，水稻生育期内不再追肥。
1.3 样品采集
试验于2020年5月12日插秧，10月7日收获。在水稻四个生育时期（分蘖期，抽穗开花期，灌浆期，成熟期）采集土壤样品，采用5点取样法，将采集到的土壤样品混合均匀，去除细根，杂物等，混匀备用。于水稻抽穗末期测定叶面积指数及叶绿素含量，计算平均值。于成熟期收获整盆植株样品，收集水稻籽粒、茎叶及根系，风干后测定水稻籽粒产量、生物产量等。同时采集水稻籽粒、秸秆及根系样品进行全氮含量分析。
1.4 测定指标与方法
混匀土壤样品用2 mol L−1氯化钾溶液浸提（土∶水 = 1∶10），在160 r min−1条件下震荡1 h，过滤得浸提液，用AA3型流动分析仪测定土壤铵态氮和硝态氮含量，两者之和称为土壤速效氮含量。
于水稻抽穗末期使用叶绿素仪及叶面积仪测定水稻叶片叶绿素含量、叶面积指数，计算平均值。于成熟期测定水稻穗数及株高，对水稻样品进行考种，将籽粒、茎叶秸秆、根系置于烘箱之中，70 ℃烘至恒重，用粉碎机粉碎，过0.5 mm筛，使用VARIO MACRO元素分析仪测定植株全氮含量。
1.5 计算方法
土壤表观硝化速率（%） = 土壤硝态氮含量/（土壤铵态氮含量 + 土壤硝态氮含量）[22]
土壤硝化抑制率（%）=（a − b）/a × 100%
a为只施普通尿素处理的土壤硝态氮含量（mg kg−1），b为添加硝化抑制剂尿素处理土壤硝态氮含量（mg kg−1）[23]
水稻植株氮积累量（g 株−1） = 水稻植株含氮量 × 水稻植株干物质重
水稻氮肥吸收利用率（%）=（施氮处理水稻氮积累量 − 不施氮肥处理水稻氮积累量）/施氮量 × 100[24]
水稻氮肥偏生产力（g g−1） = 施氮处理水稻籽粒产量/施氮量
1.6 数据处理
数据使用Microsoft Excel 2010和SPSS 21.0进行统计分析，Origin 9.0作图，采用Duncan最小显著极差法进行差异显著性检验。
2. 结果与分析
2.1 不同处理铵态氮及硝态氮变化特征
2.1.1 土壤铵态氮
由表1可知，土壤铵态氮含量随水稻生育时期进程呈现下降趋势，分蘖期土壤铵态氮含量最高。
表 1 水稻不同生育时期不同处理土壤铵态氮含量（mg kg−1）Table 1. Contents of soil ammonium nitrogen at different growth stages of rice under different treatments（mg kg−1）处理
Treatment分蘖期
Tillering抽穗开花期
Heading and flowering灌浆期
Filling成熟期
MatureCK 19.67 ± 0.30 e 17.60 ± 1.26 bc 13.95 ± 0.27 c 13.54 ± 1.22 b N 20.22 ± 0.43 e 15.02 ± 0.03 d 12.38 ± 1.12 d 11.51 ± 0.49 c H 49.59 ± 2.41 a 20.40 ± 0.53 a 11.80 ± 0.69 de 13.52 ± 0.51 b NBPT 24.57 ± 1.28 cd 20.28 ± 0.20 a 15.08 ± 0.38 bc 13.16 ± 0.75 b DMPP 27.46 ± 1.45 bc 18.84 ± 1.12 ab 12.75 ± 0.59 d 12.48 ± 0.90 bc CP 28.67 ± 1.33 b 17.98 ± 1.64 bc 15.76 ± 1.13 b 12.48 ± 0.10 bc NBPT + H 25.83 ± 2.67 bcd 17.73 ± 1.49 bc 10.87 ± 0.47 e 13.35 ± 0.93 b DMPP + H 23.12 ± 0.58 d 16.59 ± 0.34 cd 12.47 ± 0.10 d 12.86 ± 0.29 b CP + H 47.82 ± 2.17 a 20.22 ± 1.24 a 17.14 ± 0.53 a 15.62 ± 0.17 a 注：同列不同字母表示差异达5%为显著水平。 CK处理水稻分蘖期土壤铵态氮含量低于施氮处理，抽穗开花期起与其他处理土壤铵态氮含量趋于一致，可能由于CK处理水稻植株生育后期土壤矿化的氮和吸附的氮随着土壤温度的逐渐升高不断增加，再加上植株长势较弱需氮量较少，而造成土壤养分的积累。N处理在水稻生育前期土壤铵态氮含量均低于添加腐植酸及生化抑制剂处理，表明生育前期腐植酸及生化抑制剂的添加有利于土壤中铵态氮的积累，至生育后期趋于一致，可能由于后期腐植酸及生化抑制剂作用效果的减弱造成。
分蘖期H处理土壤铵态氮含量最高，为49.59 mg kg−1，与CP + H处理之间无显著差异，显著高于其他处理；添加CP的处理铵态氮含量处于较高水平， CP在水稻生育前期能有效抑制硝化作用，提高土壤铵态氮含量。DMPP处理显著高于DMPP + H处理，说明腐植酸与DMPP结合施用降低了DMPP的硝化抑制效果。抽穗开花期H处理土壤铵态氮含量最高，为20.40 mg kg−1；NBPT显著高于NBPT + H处理；DMPP显著高于DMPP + H处理；CP + H显著高于CP处理（P < 0.05）。结果表明，腐植酸的单独添加能使土壤铵态氮含量在水稻生育前期保持在较高水平，同时相比CP单独施用，腐植酸能显著提高水稻生育前期土壤铵态氮含量。添加CP处理灌浆期土壤铵态氮含量较高，在15.76 mg kg−1以上，其中CP + H显著高于CP处理； NBPT显著高于NBPT + H处理（P < 0.05）；NBPT + H处理铵态氮含量最低，为10.87 mg kg−1（表1）。成熟期各处理土壤铵态氮含量趋于一致（表1）。
2.1.2 土壤硝态氮变化
由表2可知，土壤硝态氮含量随水稻生育进程呈现先升高再降低，而后升高的趋势，可能是水稻处于淹水情况下，土壤硝化作用较弱，硝态氮缓慢累积，含量升高，后期由于水稻植株吸收养分导致含量下降，成熟期水稻吸收养分能力减弱而又造成硝态氮的积累。
表 2 水稻不同生育时期不同处理土壤硝态氮含量（mg kg-1）Table 2. Contents of soil nitrate nitrogen in different growth stages of rice under different treatments（mg kg-1）处理
Treatment分蘖期
Tillering抽穗开花期
Heading and flowering灌浆期
Grouting成熟期
MatureCK 2.63 ± 0.22 b 5.33 ± 0.03 ab 4.58 ± 0.07 a 2.58 ± 0.03 e N 2.37 ± 0.03 cd 4.74 ± 0.48 c 2.40 ± 0.10 d 3.14 ± 0.07 d H 3.05 ± 0.03 a 4.94 ± 0.28 bc 1.72 ± 0.02 e 2.76 ± 0.19 e NBPT 2.41 ± 0.00 c 4.97 ± 0.37 bc 2.67 ± 0.23 c 3.25 ± 0.05 d DMPP 2.14 ± 0.01 ef 4.63 ± 0.41 cd 2.40 ± 0.03 d 2.70 ± 0.24 e CP 2.11 ± 0.01 f 4.94 ± 0.22 bc 2.85 ± 0.15 bc 4.35 ± 0.12 b NBPT + H 2.26 ± 0.01 de 4.53 ± 0.02 cd 1.76 ± 0.09 e 5.33 ± 0.09 a DMPP + H 2.14 ± 0.01 ef 4.15 ± 0.11 d 2.83 ± 0.05 bc 2.17 ± 0.16 f CP + H 2.22 ± 0.01 ef 5.80 ± 0.22 a 2.94 ± 0.15 b 3.62 ± 0.21 c 注：同列不同字母表示差异达5%为显著水平。 分蘖期H处理土壤硝态氮含量最高，为3.05 mg kg−1，显著高于其他处理，表明腐植酸具有促进硝化作用的效果。NBPT处理硝态氮含量较高，为2.41 mg kg−1，显著高于NBPT + H处理；CP处理土壤硝态氮含量最低，为2.11 mg kg−1（表2）。抽穗开花期CP + H处理土壤硝态氮含量最高，为5.80 mg kg−1，显著高于其他处理；NBPT处理较高，为4.97 mg kg−1，与NBPT + H处理之间无显著差异； DMPP + H处理硝态氮含量最低，为4.15mg kg−1（表2）（P < 0.05）。添加CP及单独添加腐植酸处理的土壤硝态氮含量在水稻抽穗开花期均保持在较高水平。灌浆期CK土壤硝态氮含量最高，为4.58 mg kg−1，显著高于其他处理，可能由于CK没有抑制剂，土壤硝态氮产生量相对较大，造成土壤中硝态氮的累积。CP + H含量较高，为2.94 mg kg−1，与CP处理之间无显著差异；NBPT显著高于NBPT + H处理；DMPP + H显著高于DMPP处理（P < 0.05）；H处理硝态氮含量最低，为1.72 mg kg−1（表2）。成熟期NBPT + H处理土壤硝态氮含量最高，为5.33 mg kg−1，显著高于其他处理；CP处理较高，为4.35 mg kg−1，显著高于CP + H处理；DMPP显著高于DMPP + H处理，DMPP + H处理硝态氮含量最低，为2.17 mg kg−1（表2）（P < 0.05）。
2.2 不同处理对黑土表观硝化率的影响
由图1可知，土壤表观硝化率随水稻生育进程呈现先升高后降低，再升高的规律，与土壤硝态氮含量变化规律相一致（P < 0.05）。
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图 1 水稻不同生育时期不同处理土壤表观硝化率（%）Figure 1. Apparent nitrification rates (%) of soil at different growth stages of rice under different treatments（%）CK处理表观硝化率在水稻生育前期均处于较高水平，至成熟期有所下降，是由于没有添加生化抑制剂，土壤中铵态氮硝化速率较快，CK处理水稻植株吸养能力较弱，而导致表观硝化率较高，成熟期由于土壤铵态氮含量减少，土壤硝化反应减弱，产生的硝态氮量减少，而导致表观硝化率的降低。
分蘖期N处理表观硝化率较高，为10.49%，高于添加硝化抑制剂处理，说明硝化抑制剂的添加在水稻分蘖期能够有效抑制土壤硝化作用的进行。DMPP + H处理显著高于DMPP处理；CP显著高于CP + H处理，CP + H处理土壤表观硝化率最低，为4.44%（图1）（P < 0.05）。水稻生育前期，添加CP表观硝化率均低于添加DMPP处理，说明CP具有更好地硝化抑制效果，与土壤铵态氮含量特征一致。抽穗开花期N处理土壤表观硝化率最高，为23.93%，与CP、CP + H处理之间无显著差异，显著高于其他处理，表明硝化抑制剂的存在水稻抽穗开花期仍能起到较好的硝化抑制效果（P < 0.05）。H处理表观硝化率最低，为19.49%（图1）。结果表明，添加CP处理在抽穗开花期表观利用率较高，可能由于抽穗开花期添加CP土壤铵态氮含量较高，硝化作用底物浓度较高所产生的硝态氮较多，造成表观硝化率的提高。灌浆期N处理与其他处理之间趋于一致，表明至灌浆期腐植酸及生化抑制剂的作用效果有所降低。DMPP + H处理表观硝化率较高，为18.49%，显著高于DMPP处理； H处理土壤表观硝化率最低，为12.74%（图1）。成熟期NBPT + H处理土壤最高，为28.58%，显著高于其他处理。CP处理表观硝化率较高，为25.85%，显著高于CP + H处理；DMPP显著高于DMPP + H处理，DMPP + H处理土壤表观硝化率最低，为14.46%（图1）（P < 0.05）。
2.3 不同处理对水稻分蘖期黑土硝化抑制率的影响
由图2可知，水稻分蘖期，硝化抑制剂DMPP、CP均可以有效抑制硝化作用，硝化抑制率分别为9.70%，10.82%。CP的硝化抑制率显著高于DMPP，表明CP具有更好的硝化抑制能力，这与速效氮及表观硝化率变化特征相一致（图2）；NBPT + H硝化抑制率显著高于NBPT和H处理；DMPP与DMPP + H处理之间无显著差异（P < 0.05）；H处理硝化抑制率最低，为−28.77%（图2）。结果表明，单独施用腐植酸不具有硝化抑制能力，反而会促进硝化作用，可能是腐植酸可以促进土壤微生物活性所致。与NBPT或腐植酸的单独施用相比，腐植酸与NBPT结合可以显著提高硝化抑制率，说明二者结合具有有效抑制土壤硝化反应的功能。相比DMPP单独施用，腐植酸与DMPP结合并未对硝化抑制率产生显著影响。与CP单独施用相比，腐植酸与CP结合显著降低硝化抑制率，综合CP + H处理铵态氮含量及表观硝化率分析，可能是两者配合施用会提高硝化作用底物浓度，同时促进微生物活性，进而增强土壤硝化作用强度导致。
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图 2 不同处理水稻分蘖期土壤硝化抑制率（%）图柱不同字母表示表示差异达5%为显著水平。Figure 2. Nitrification inhibition rates (%) of soil in rice tillering stage under different treatments（%）2.4 不同处理对水稻生长指标的影响
2.4.1 水稻株高
由表3可知，相比单独施用抑制剂，腐植酸的添加处理水稻株高有升高趋势，但未造成显著影响，其中CP + H处理水稻株高最高，达到84.68 cm， H处理株高最低，为79.16 cm（P < 0.05）。
表 3 不同处理水稻生长指标Table 3. Growth index of rice under different treatments处理
Treatment株高（cm）
Plant height分蘖数（个）
Tiller number叶绿素（SPAD）
Chlorophyll content叶面积指数（cm2）
Leaf areaCK 71.98 ± 1.94 c 7.53 ± 0.31 d 7.43 ± 0.31 e 24.33 ± 2.46 c N 84.32 ± 1.20 a 10.27 ± 0.31 c 19.52 ± 0.07 d 25.56 ± 0.83 c H 79.16 ± 4.73 b 11.67 ± 0.12 ab 21.70 ± 1.63 a 29.60 ± 0.73 b NBPT 82.67 ± 2.25 ab 10.47 ± 0.81 c 20.95 ± 0.14 abc 29.92 ± 3.78 b DMPP 79.06 ± 0.59 b 11.53 ± 0.61 ab 21.27 ± 0.88 ab 30.13 ± 0.41 b CP 84.20 ± 0.21 a 11.13 ± 0.61 bc 19.86 ± 0.04 cd 34.45 ± 1.85 a NBPT + H 84.19 ± 4.62 a 11.87 ± 0.76 ab 21.53 ± 0.81 ab 27.53 ± 0.79 bc DMPP + H 81.46 ± 1.65 ab 12.13 ± 0.50 a 22.06 ± 0.05 a 27.31 ± 0.94 bc CP + H 84.68 ± 0.66 a 11.67 ± 0.12 ab 20.30 ± 0.33 bcd 29.75 ± 1.02 b 注：同列不同字母表示差异达5%为显著水平。 2.4.2 水稻分蘖数
相比DMPP、CP单独施用，腐植酸的添加均提高水稻分蘖数，分别提高13.38%，5.20%，4.79%，其中NBPT显著高于NBPT + H处理。（表3）。
2.4.3 水稻叶片叶绿素含量
相比NBPT、DMPP、CP单独施用，腐植酸均不同程度提高了水稻叶片叶绿素含量，分别提高2.80%，3.71%，2.25%，但均未造成显著影响（P < 0.05）（表3）。
2.4.4 水稻叶面积
与NBPT、DMPP、CP单独施用相比，腐植酸均不同程度降低了水稻叶片叶面积，分别降低7.98%，9.34%，13.66%，其中CP + H处理显著低于CP处理（P < 0.05）（表3）。
相比单独施用尿素肥料，腐植酸及生化抑制剂结合均能提高水稻分蘖数、叶片叶绿素含量及叶面积，平均提高11.93%，8.08%，16.64%。与NBPT、DMPP、CP单独施用相比，添加腐植酸水稻株高、分蘖数及叶绿素含量均呈现升高趋势，但叶片叶面积均有所下降，可能是腐植酸能够促进水稻生长，促进分蘖及叶绿素的合成，腐植酸与生化抑制剂的配合施用降低了生化抑制剂对水稻叶面积的增加作用。
2.5 不同处理对水稻产量、吸氮量及氮肥利用效率的影响
2.5.1 不同处理对水稻生物产量的影响
由表4可知，DMPP处理水稻生物产量最高，达到363.89 g，显著高于其他处理；相比NBPT、CP单独施用，腐植酸的添加对水稻生物产量未造成显著影响。H处理生物产量最低，为306.99 g。
表 4 不同处理水稻产量、吸氮量及氮肥利用效率Table 4. Yield, nitrogen uptake, nitrogen use efficiency of rice under different treatments处理
Treatment生物产量（g pot−1）
Total biomass籽粒产量（g pot−1）
Grain yield籽粒吸氮量（g pot−1）
Grain N uptake总吸氮量（g pot−1）
Total N uptake氮肥利用率（%）
NUE氮肥偏生产力（g g−1）
NPFPCK 182.91 ± 4.23 d 58.76 ± 1.33 g 0.66 ± 0.05 f 1.28 ± 0.09 d − − N 306.12 ± 15.77 c 76.29 ± 2.22 f 0.90 ± 0.08 e 2.39 ± 0.04 c 26.54 ± 1.03 c 18.17 ± 0.53 e H 306.99 ± 18.72 c 104.01 ± 4.61 bc 1.23 ± 0.07 bc 2.45 ± 0.12 c 27.75 ± 2.79 c 24.76 ± 1.10 ab NBPT 317.63 ± 14.62 bc 99.82 ± 2.29 cd 1.15 ± 0.01 c 2.67 ± 0.12 b 33.19 ± 2.88 b 23.77 ± 0.55 bc DMPP 363.89 ± 5.28 a 111.24 ± 2.26 a 1.36 ± 0.05 a 3.00 ± 0.07 a 40.84 ± 1.57 a 26.49 ± 0.54 a CP 329.38 ± 2.12 bc 98.74 ± 5.61 cd 1.17 ± 0.11 c 2.73 ± 0.10 b 34.46 ± 2.47 b 23.51 ± 1.34 bc NBPT + H 310.72 ± 16.24 bc 85.03 ± 2.85 e 1.02 ± 0.08 d 2.60 ± 0.07 b 31.45 ± 1.56 b 20.25 ± 0.68 d DMPP + H 307.00 ± 8.84 c 94.23 ± 3.32 d 1.14 ± 0.04 c 2.68 ± 0.07 b 33.40 ± 1.76 b 22.44 ± 0.79 c CP + H 333.13 ± 18.03 bc 109.62 ± 6.64 ab 1.33 ± 0.06 ab 3.09 ± 0.03 a 43.01 ± 0.80 a 26.10 ± 1.58 a 注：同列不同字母表示差异达5%为显著水平。 2.5.2 不同处理对水稻籽粒产量的影响
DMPP处理水稻籽粒产量最高，达到111.24 g，与CP + H处理之间无显著差异，显著高于其他处理；相比NBPT、CP单独施用，腐植酸的添加显著降低水稻籽粒产量。NBPT + H处理籽粒产量最低，为85.03 g（表4）。
相比单独施用尿素肥料，腐植酸及生化抑制剂均提高了水稻生物产量及籽粒产量，平均提高5.88%，31.58%。与NBPT单独施用相比，添加腐植酸不同程度降低了水稻生物产量及籽粒产量，分别降低2.17%，14.82%。相比DMPP单独施用，添加腐植酸显著降低水稻生物产量及籽粒产量，分别降低15.63%，15.29%，DMPP与腐植酸配合施用不利于水稻增产。相比CP单独施用，添加腐植酸提高了水稻生物产量及籽粒产量，分别提高1.14%，11.01%，其中对水稻籽粒产量影响显著。
2.5.3 不同处理对水稻籽粒吸氮量的影响
DMPP处理籽粒吸氮量最高，达到1.36 g，与CP + H处理之间无显著差异，显著高于其他处理；相比NBPT、CP单独施用，腐植酸的添加显著降低水稻籽粒吸氮量。NBPT + H处理籽粒吸氮量最低，为1.02 g（表4）。
2.5.4 不同处理对水稻总吸氮量的影响
CP + H处理总吸氮量最高，达到3.09 g，与DMPP处理之间无显著差异，显著高于其他处理；NBPT与NBPT + H处理之间无显著差异H处理总吸氮量最低，为2.45 g（表4）。
2.5.5 不同处理对氮肥利用率的影响
CP + H处理氮肥利用率最高，达到43.01%，与DMPP处理无显著差异，显著高于其他处理；NBPT与NBPT + H处理无显著差异（P < 0.05）；H处理氮肥利用率最低，为27.75%（表4）。
2.5.6 不同处理对氮肥偏生产力的影响
DMPP处理氮肥偏生产力最高，达到26.49 g g−1，与H、CP + H处理之间无显著差异，显著高于其他处理；NBPT显著高于NBPT + H处理（P < 0.05）；NBPT + H处理氮肥偏生产力最低，为20.25 g g−1（表4）。
相比单独施用尿素肥料，添加腐植酸及生化抑制剂均提高水稻籽粒吸氮量、总吸氮量、氮肥利用率及偏生产力，分别提高33.15%，14.84%，31.39%，31.49%。相比NBPT和DMPP单独施用，添加腐植酸降低水稻籽粒吸氮量、总吸氮量、氮肥利用率及偏生产力，分别降低11.66%，2.73%，5.25%，14.82%和2.51%，10.44%，18.23%，15.29%。可能由于腐植酸与NBPT、DMPP配合施用不利于水稻植株对氮素的吸收，进而导致氮肥利用率及偏生产力的下降。相比CP单独施用，添加腐植酸显著提高籽粒吸氮量、总吸氮量、氮肥利用率及偏生产力，分别提高14.04%，13.15%，24.78%，11.01%，CP与腐植酸配合施用能增强水稻对氮的吸收，进而提高氮肥利用率及偏生产力。
2.6 不同处理对水稻地上部及地下部干物质分配比例的影响
由图3可知，CK处理地下部干物质分配比例与H、NBPT、CP、NBPT + H、CP + H处理之间无显著差异，显著高于N、DMPP处理，显著低于DMPP + H处理（P < 0.05）。添加腐植酸处理水稻地下部干物质占比均高于单独施用尿素处理，平均提高21.64%，说明腐植酸的添加能够有效促进水稻根系的发育，提高地下部干物质积累量。DMPP + H处理地下部干物质占比最高，达到19.82%，显著高于其他处理；NBPT、CP、NBPT + H、CP + H处理之间无显著差异（P < 0.05）；与NBPT、DMPP、CP单独施用相比，添加腐植酸均提高水稻地下部干物质占比，分别提高3.89%，52.65%，9.04%，进一步印证腐植酸对水稻根系发育的促进效果。
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图 3 不同处理水稻地上部及地下部干物质分配比例Figure 3. Proportion of dry matter distribution between aboveground and underground parts of rice under different treatments3. 讨论
研究结果表明，黑土栽培水稻施用添加不同种类生化抑制剂的稳定性尿素均对土壤铵态氮及硝态氮含量有显著的调控作用，延缓尿素态氮向铵态氮，进而向硝态氮转化的生物化学进程，与已有的研究结果相符[25]。在黑土中相比单独施用尿素，腐植酸与尿素配合施用在水稻生育前期显著提高速效氮含量，是因腐植酸通过与尿素发生络合作用[26]，同时能够抑制脲酶活性[27]，使尿素具备一定的缓释性能，延缓尿素水解，减少氨挥发损失，进而提高速效氮含量。同时腐植酸能够提高土壤微生物活性[20]，促进硝化作用的进行，与添加腐植酸的尿素处理土壤硝态氮含量及硝化抑制率变化特征相一致。NBPT主要是通过抑制土壤脲酶活性以起到延缓尿态氮向铵态氮转化的作用，与腐植酸抑制脲酶活性的作用机理相近，二者在抑制尿素水解方面存在协同作用，同时由于硝化作用底物含量的减少，降低了土壤硝化作用的效果，这与NBPT + H处理表观硝化率及水稻苗期硝化抑制率变化特征一致。相比DMPP单独施用，腐植酸的添加降低了土壤铵态氮含量，腐植酸能使尿素具备一定缓释性能导致铵态氮含量较少。相比DMPP处理，DMPP + H处理表观硝化率的显著提高及硝化抑制率的显著降低，是由于在有机质含量高的土壤中，DMPP的施用效果会明显下降[28]，腐植酸的添加能够提高土壤有机质含量[29]，降低了DMPP硝化抑制效果，因此二者结合产生的负效应大于正效应。相比CP单独施用，腐植酸的添加提高了水稻生育前期土壤速效氮含量，显著降低土壤表观硝化率，由于腐植酸与CP配合施用分别抑制尿素水解过程与氨氧化过程，二者对于抑制水田尿素态氮向硝态氮的转化具有协同增效作用。
相比普通尿素，腐植酸的添加显著提高水稻分蘖数，叶绿素含量及叶面积指数，证明腐植酸具有促进植株生长，促进植株光合作用的功能，这与已有研究结果相同[30-31]，而添加腐植酸尿素的水稻株高显著降低。已有研究认为，植株株高可以影响抗倒伏能力，通常株高越高抗倒伏能力越差[32]，有研究表明腐植酸的添加又可以提高植物抗逆性[33]，结合本试验结果认为腐植酸具有提高水稻植株抗倒伏的能力。相比生化抑制剂NBPT、DMPP、CP单独施用，腐植酸均提高水稻株高，分蘖数及叶片叶绿素含量，但叶面积指数均有所降低，可能是腐植酸与生化抑制剂结合减弱了腐植酸对水稻株高的降低效果，导致二者配施处理水稻株高的增加。同时水稻叶片叶绿素含量的提高，标志着单位面积水稻叶片光合作用能力的加强，较少的叶面积便可以满足植株生长的需要，因此二者配施处理水稻叶面积呈现下降趋势。
在黑土上栽培水稻时，尿素肥料的施用能显著提高作物产量。相比普通尿素，腐植酸能够显著提高水稻籽粒产量、籽粒吸氮量、氮肥偏生产力，同时能提高水稻地下部干物质占比，但并未对生物产量、总吸氮量、氮肥利用率产生显著影响，主要是添加腐植酸能够促进水稻植株干物质积累及养分向籽粒转移，提高经济效益。相比单独施用尿素，添加生化抑制剂NBPT、DMPP、CP提高了水稻生物产量、籽粒产量、籽粒吸氮量、总吸氮量、氮肥利用率及偏生产力，与已有研究结果相符[3,12]。相比NBPT单独施用，与腐植酸结合显著降低了水稻籽粒产量、籽粒吸氮量及氮肥偏生产力，对水稻生物产量、植株总吸氮量及氮肥利用率无显著影响，同时水稻地下部干物质积累量升高，主要是腐植酸的添加促进了根系的发育，增加了干物质在水稻地下部的积累，地上部干物质量降低，籽粒产量减少，经济效益下降。相比DMPP单独施用，添加腐植酸显著降低水稻生物产量、籽粒产量、籽粒吸氮量、总吸氮量、氮肥利用率及偏生产力，与DMPP + H处理土壤速效氮含量及硝化抑制率变化规律相一致，腐植酸与DMPP配合施用不利于水稻的增产及氮肥利用率的提高。相比CP单独施用，腐植酸的添加显著提高了水稻籽粒产量、籽粒吸氮量、植株吸氮量、氮肥利用率及偏生产力，同时生物产量也有所提高，与CP + H处理土壤养分变化规律一致，是由于腐植酸的施用能够促进根系发育[34]，提高水稻植株吸收养分能力所致，同时研究发现，CP与腐植酸配合施用能够提高速效氮含量，进而提高水稻产量、吸氮量及氮肥利用率。
4. 结论
（1）黑土上栽培水稻时，相比传统应用添加单一生化抑制剂稳定性尿素肥料，添加腐植酸增效尿素肥料可以提高水稻株高、分蘖数及叶绿素含量，而叶面积却有所降低。
（2）腐植酸与CP结合可以有效抑制土壤中尿素态氮向铵态氮转化，进而向硝态氮转化，促进水稻根系发育，提高水稻产量及氮肥利用率。
（3）腐植酸与NBPT结合能够有效延缓尿素态氮向铵态氮转化的生物化学进程，但会增加干物质在水稻地下部的积累，造成水稻籽粒产量的显著降低，导致水稻栽培经济效益下降。
（4）腐植酸与DMPP结合降低土壤速效氮含量及硝化抑制率，不利于DMPP作用效果的发挥，显著降低水稻产量及氮肥利用率。
将腐植酸与生化抑制剂联合添加处理中，CP与腐植酸配合效果最好。
综上，黑土上栽培水稻，应采用添加腐植酸与CP结合制成的新型高效稳定性增效尿素肥料，不建议将腐植酸与DMPP、NBPT结合添加尿素中施用。
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图 1 水稻不同生育时期不同处理土壤表观硝化率（%）
Figure 1. Apparent nitrification rates (%) of soil at different growth stages of rice under different treatments（%）
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图 2 不同处理水稻分蘖期土壤硝化抑制率（%）
图柱不同字母表示表示差异达5%为显著水平。
Figure 2. Nitrification inhibition rates (%) of soil in rice tillering stage under different treatments（%）
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图 3 不同处理水稻地上部及地下部干物质分配比例
Figure 3. Proportion of dry matter distribution between aboveground and underground parts of rice under different treatments
表 1 水稻不同生育时期不同处理土壤铵态氮含量（mg kg−1）
Table 1 Contents of soil ammonium nitrogen at different growth stages of rice under different treatments（mg kg−1）
处理
Treatment分蘖期
Tillering抽穗开花期
Heading and flowering灌浆期
Filling成熟期
MatureCK 19.67 ± 0.30 e 17.60 ± 1.26 bc 13.95 ± 0.27 c 13.54 ± 1.22 b N 20.22 ± 0.43 e 15.02 ± 0.03 d 12.38 ± 1.12 d 11.51 ± 0.49 c H 49.59 ± 2.41 a 20.40 ± 0.53 a 11.80 ± 0.69 de 13.52 ± 0.51 b NBPT 24.57 ± 1.28 cd 20.28 ± 0.20 a 15.08 ± 0.38 bc 13.16 ± 0.75 b DMPP 27.46 ± 1.45 bc 18.84 ± 1.12 ab 12.75 ± 0.59 d 12.48 ± 0.90 bc CP 28.67 ± 1.33 b 17.98 ± 1.64 bc 15.76 ± 1.13 b 12.48 ± 0.10 bc NBPT + H 25.83 ± 2.67 bcd 17.73 ± 1.49 bc 10.87 ± 0.47 e 13.35 ± 0.93 b DMPP + H 23.12 ± 0.58 d 16.59 ± 0.34 cd 12.47 ± 0.10 d 12.86 ± 0.29 b CP + H 47.82 ± 2.17 a 20.22 ± 1.24 a 17.14 ± 0.53 a 15.62 ± 0.17 a 注：同列不同字母表示差异达5%为显著水平。 
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表 2 水稻不同生育时期不同处理土壤硝态氮含量（mg kg-1）
Table 2 Contents of soil nitrate nitrogen in different growth stages of rice under different treatments（mg kg-1）
处理
Treatment分蘖期
Tillering抽穗开花期
Heading and flowering灌浆期
Grouting成熟期
MatureCK 2.63 ± 0.22 b 5.33 ± 0.03 ab 4.58 ± 0.07 a 2.58 ± 0.03 e N 2.37 ± 0.03 cd 4.74 ± 0.48 c 2.40 ± 0.10 d 3.14 ± 0.07 d H 3.05 ± 0.03 a 4.94 ± 0.28 bc 1.72 ± 0.02 e 2.76 ± 0.19 e NBPT 2.41 ± 0.00 c 4.97 ± 0.37 bc 2.67 ± 0.23 c 3.25 ± 0.05 d DMPP 2.14 ± 0.01 ef 4.63 ± 0.41 cd 2.40 ± 0.03 d 2.70 ± 0.24 e CP 2.11 ± 0.01 f 4.94 ± 0.22 bc 2.85 ± 0.15 bc 4.35 ± 0.12 b NBPT + H 2.26 ± 0.01 de 4.53 ± 0.02 cd 1.76 ± 0.09 e 5.33 ± 0.09 a DMPP + H 2.14 ± 0.01 ef 4.15 ± 0.11 d 2.83 ± 0.05 bc 2.17 ± 0.16 f CP + H 2.22 ± 0.01 ef 5.80 ± 0.22 a 2.94 ± 0.15 b 3.62 ± 0.21 c 注：同列不同字母表示差异达5%为显著水平。
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表 3 不同处理水稻生长指标
Table 3 Growth index of rice under different treatments
处理
Treatment株高（cm）
Plant height分蘖数（个）
Tiller number叶绿素（SPAD）
Chlorophyll content叶面积指数（cm2）
Leaf areaCK 71.98 ± 1.94 c 7.53 ± 0.31 d 7.43 ± 0.31 e 24.33 ± 2.46 c N 84.32 ± 1.20 a 10.27 ± 0.31 c 19.52 ± 0.07 d 25.56 ± 0.83 c H 79.16 ± 4.73 b 11.67 ± 0.12 ab 21.70 ± 1.63 a 29.60 ± 0.73 b NBPT 82.67 ± 2.25 ab 10.47 ± 0.81 c 20.95 ± 0.14 abc 29.92 ± 3.78 b DMPP 79.06 ± 0.59 b 11.53 ± 0.61 ab 21.27 ± 0.88 ab 30.13 ± 0.41 b CP 84.20 ± 0.21 a 11.13 ± 0.61 bc 19.86 ± 0.04 cd 34.45 ± 1.85 a NBPT + H 84.19 ± 4.62 a 11.87 ± 0.76 ab 21.53 ± 0.81 ab 27.53 ± 0.79 bc DMPP + H 81.46 ± 1.65 ab 12.13 ± 0.50 a 22.06 ± 0.05 a 27.31 ± 0.94 bc CP + H 84.68 ± 0.66 a 11.67 ± 0.12 ab 20.30 ± 0.33 bcd 29.75 ± 1.02 b 注：同列不同字母表示差异达5%为显著水平。
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表 4 不同处理水稻产量、吸氮量及氮肥利用效率
Table 4 Yield, nitrogen uptake, nitrogen use efficiency of rice under different treatments
处理
Treatment生物产量（g pot−1）
Total biomass籽粒产量（g pot−1）
Grain yield籽粒吸氮量（g pot−1）
Grain N uptake总吸氮量（g pot−1）
Total N uptake氮肥利用率（%）
NUE氮肥偏生产力（g g−1）
NPFPCK 182.91 ± 4.23 d 58.76 ± 1.33 g 0.66 ± 0.05 f 1.28 ± 0.09 d − − N 306.12 ± 15.77 c 76.29 ± 2.22 f 0.90 ± 0.08 e 2.39 ± 0.04 c 26.54 ± 1.03 c 18.17 ± 0.53 e H 306.99 ± 18.72 c 104.01 ± 4.61 bc 1.23 ± 0.07 bc 2.45 ± 0.12 c 27.75 ± 2.79 c 24.76 ± 1.10 ab NBPT 317.63 ± 14.62 bc 99.82 ± 2.29 cd 1.15 ± 0.01 c 2.67 ± 0.12 b 33.19 ± 2.88 b 23.77 ± 0.55 bc DMPP 363.89 ± 5.28 a 111.24 ± 2.26 a 1.36 ± 0.05 a 3.00 ± 0.07 a 40.84 ± 1.57 a 26.49 ± 0.54 a CP 329.38 ± 2.12 bc 98.74 ± 5.61 cd 1.17 ± 0.11 c 2.73 ± 0.10 b 34.46 ± 2.47 b 23.51 ± 1.34 bc NBPT + H 310.72 ± 16.24 bc 85.03 ± 2.85 e 1.02 ± 0.08 d 2.60 ± 0.07 b 31.45 ± 1.56 b 20.25 ± 0.68 d DMPP + H 307.00 ± 8.84 c 94.23 ± 3.32 d 1.14 ± 0.04 c 2.68 ± 0.07 b 33.40 ± 1.76 b 22.44 ± 0.79 c CP + H 333.13 ± 18.03 bc 109.62 ± 6.64 ab 1.33 ± 0.06 ab 3.09 ± 0.03 a 43.01 ± 0.80 a 26.10 ± 1.58 a 注：同列不同字母表示差异达5%为显著水平。
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