【研究意义】溶解性有机碳（DOC）是土壤有机质的重要组成部分，也是土壤有机质中最活跃的组分之一，具有高度流动性和不稳定性^[1-2]。土壤DOC主要来源于动植物残体、根系分泌物、土壤微生物活动及有机质分解等^[3]，是具有不同结构的有机分子的混合体^[4]，且不同组分的生物活性和生态作用各不相同^[5]。DOC含量和质量对调节土壤肥力、植物生长、微生物生长代谢及养分循环都具有重要作用^[6]。【前人研究进展】生物炭作为秸秆资源化利用的有效途径及固碳减排的重要功能性材料^[6-7]，具有含碳量高、比表面积大、孔隙结构丰富、碳稳定性强等特点^[8-9]，在水土保持^[10]、改善土壤质量^[11]、固碳减排^[12]、阻控土壤酸化^[13]、增加作物产量^[14]等方面具有良好的应用潜力。研究表明添加生物炭能够增加土壤有机质含量，促进作物对营养物质的吸收^[15]，并通过影响DOC的分子组成进而增强DOC的稳定性，减少其淋溶损失^[16-17]。近年来，随着政府对秸秆焚烧的严厉管控和全面提升离田秸秆综合利用效率迫切需求，秸秆生物炭业已成为旱地红壤控酸培肥固碳的重要材料之一。【本研究切入点】目前对生物炭影响土壤有机碳含量和组成的研究多集中在生物炭一次性大量施用的短期影响上^[17-18]，但南方红壤区生物炭一次大量施用，不但经济成本高，同时因南方红壤区春蚀秋旱的气候特点，致使70%以上的生物炭随径流而流失，成为秸秆生物炭在红壤旱地推广应用的瓶颈。本团队前期研究结果表明施用少量生物炭能提高土壤pH，增加土壤有机碳含量和作物产量^[19-21]，但低量生物炭连续施用对土壤有机碳、DOC含量和组成的长期效应仍不明确。三维荧光光谱通过改变激发波长与发射光波长获取相关物质的荧光特征，是一种快速、灵敏的检测技术，具有灵敏度高、信息量大、快速且受化学药品影响较小等优点^[2,22]，近年来被广泛应用于定性区分和定量测定土壤中DOC的组成、来源及结构特征^[23-24]。【拟解决的问题】本文以2013年开展的长期定位试验为平台，采用三维荧光光谱技术，研究低量生物炭长期连续施用土壤DOC含量及结构特征变化，探究其与土壤酸度指标的关系，以期为生物炭利用的可持续性、旱地红壤土壤碳库稳定性的深入研究以及旱地红壤肥力稳定提升和酸化防治“共赢”提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验地概况

试验地位于江西省红壤研究所（116°20′24″ E，28°15′30″ N），该区域属于中亚热带季风气候，无霜期282 d，年均气温17.5 ℃，年均降雨量1587 mm，年蒸发量1100 ~ 1200 mm，年均日照时数1900 ~ 2000 h。土壤类型为第四纪黏土母质发育而成的红壤，0 ~ 20 cm耕层土壤基本理化性质：pH（H₂O）5.0，阳离子交换量（CEC）13.93 coml kg⁻¹，有机质含量12.18 g kg⁻¹，全氮（N）含量1.64 g kg⁻¹，全磷（P）含量1.01 g kg⁻¹，全钾（K）含量7.73 g kg⁻¹。

1.2   试验设计

定位试验始于2013年，根据全国小麦/水稻等秸秆每公顷每季产量，按照秸秆炭化率30%计算得到的每公顷秸秆生物炭量（500 ℃，4 h）^[12]，设置不施秸秆生物炭（对照，CK）、半量炭化还田（C1）和全量炭化还田（C2）3个处理（当地秸秆产生量为6000 ~ 7500 kg hm⁻²，可收集量约4500 kg hm⁻²左右，按照秸秆全量炭化还田的用量约为1500 kg hm⁻²，半量炭化还田量约为750 kg hm⁻²），每个处理3次重复，随机区组排列，小区面积21 m²（3.5 m × 6.0 m）。

供试生物炭由小麦秸秆于450 ℃条件下厌氧烧制而成，购于河南商丘三利新能源有限公司，制备率约为35%，其基本理化性质为：pH 10.35，有机碳 467.20 g kg⁻¹，全N 5.90 g kg⁻¹，全P 14.43 g kg⁻¹，有效P 4.70 mg kg⁻¹，全K 11.50 g kg⁻¹，CEC 21.70 cmol kg⁻¹。生物炭每年4月底施入（油菜收获后），施用方法为表层施用，再翻耕。试验采用红薯－油菜轮作（当地常用的轮作模式），每年5 ~ 9月种植红薯（苏薯8号），10月至次年4月种植油菜（丰油730）。试验地各处理施肥按N 150 kg hm⁻²、P₂O₅ 60 kg hm⁻²、K₂O 75 kg hm⁻²施加，油菜肥料分2次施用，基施70%氮肥、80%钾肥和全部磷肥，冬前追施剩余的氮肥和钾肥，各季作物栽培方式和田间管理措施按照当地习惯进行。

1.3   测定指标及方法

在油菜收获前1 d，每个小区随机采5株油菜，风干后考查每株角果数、每角粒数和千粒质量。2016 ~ 2020年，分小区单独收获籽粒，晾干后测定实际产量。

2020年油菜收获后，按五点取样法采集0 ~ 20 cm土层土壤样品，在室内剔除石砾、肉眼可见的植物残体及根系等杂质后，一部分自然风干磨碎过筛，另一部分鲜土样密封并保存于4 ℃冰箱中备用。土壤pH、交换性氢（H⁺）、交换性铝（Al³⁺）和土壤有机质含量均采用常规分析方法测定^[25]（本试验中土壤交换性H⁺和Al³⁺都是潜性酸）。土壤微生物量碳（MBC）通过K₂SO₄溶液浸提，并采用氯仿熏蒸浸提方法测定。

土壤DOC采用水浸提法提取，按水土比5∶1充分摇匀分散后震荡30 min，离心10 min（4000 r min⁻¹），上清液采用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液于4 ℃下保存待测，待测液采用TOC分析仪（Vario TOC cube，德国）测定DOC含量，待测液采用荧光光谱分析仪（CaryEclipse G9800A Hitachi F-4500，日本）进行三维荧光光谱分析。三维荧光光谱分析中所测结果均扣除超纯水的三维荧光光谱；测定时将待测液DOC浓度稀释至10 mg L⁻¹，以最大程度地减少内部过滤影响并使它们可相互对比。使用光程为1 cm的石英比色皿，扫描速度为1200 nm min⁻¹，激发和发射狭缝宽度为5 nm，其中，激发波长（Ex）200 ~ 500 nm，步长10 nm，发射波长（Em）250 ~ 600 nm，步长5 nm。根据陈诗雨等^[22]提出的荧光区域积分法，将三维荧光光谱划分为5个区域，通过计算各区域积分体积，然后对各积分体积进行标准化后计算各区域标准积分体积所占比例，并引入荧光光谱指数（表1和表2），以进一步分析不同处理下DOC荧光组分的差异。

表  1  水溶性有机碳（DOC）三维荧光5个常见荧光峰区域特征^[26]

Table  1.  Five common fluorescent peaks in three-dimensional fluorescence of dissolved organic carbon

荧光谱峰 Fluorescence peak	荧光峰激发和发射波长范围 Excitation and emission wavelength range of fluorescence peak	荧光基团 Fluorophore
PeakI	λex = 200 ~ 250 nm, λem = 280 ~ 330 nm	类酪氨酸蛋白质物质
PeakII	λex = 200 ~ 250 nm, λem = 330 ~ 380 nm	类色氨酸蛋白质物质
PeakIII	λex = 200 ~ 250 nm, λem = 380 ~ 550 nm	类富里酸物质
PeakIV	λex = 250 ~ 280 nm, λem = 280 ~ 380 nm	微生物代谢产物
PeakV	λex = 250 ~ 400 nm, λem = 380 ~ 550 nm	类腐殖酸（大腐殖酸）物质

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表  2  水溶性有机碳（DOC）三维荧光光谱指标描述^[27]

Table  2.  Description of three-dimensional fluorescence spectra of dissolved organic carbon

荧光光谱指标 Fluorescence spectral index	计算方法 Method of calculation	意义 Significance
荧光指数（FI）	f450 nm/f500 nm, λEx = 370 nm	表征微生物来源有机质占总有机质的比例
腐殖化指数（HIX）	f435-480 nm/f300-345 nm, λEx = 255 nm	表征腐殖化程度，值越大，土壤溶解性有机质腐殖化程度越高，结构越复杂
生源指数（BIX）	380/430, λEx = 310 nm	表示新产生的微生物来源的土壤溶解性有机质在总 土壤溶解性有机质中所占 的比例, 值越大表示微生物来源的土壤溶解性有机质比重较大
新鲜度指数（β:α）	380/420-435, λEx = 310 nm	反映新生土壤溶解性有机质的比例占整体土壤溶解性有机质比例
注：fX:发射波长为x时的荧光强度；λEx:激发波长；λEm:发射波长。

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1.4   数据处理

采用Excel对数据进行整理和分析，并通过R语言软件程序包ggplot2软件进行作图。不同处理间作物产量、土壤理化性质及土壤DOC结构指标的显著差异性采用单因素方差分析，并通过Tukey HSD检验法对各处理进行差异显著性检验，并对不同处理土壤pH、交换性H⁺、交换性Al³⁺等土壤理化指标与土壤DOC及其荧光光谱特征进行相关性分析和冗余分析。图表中数据为平均值±标准误差。

2.   结果与分析

2.1   施用生物炭对油菜产量的影响

由图1可知，低量生物炭连续施用可以提高油菜产量。2020年，C1和C2处理油菜产量分别较CK处理增加3.5%和20.3%，其中，C2处理达显著水平。此外，通过对各处理连续5年（2016 ~ 2020）油菜平均产量的比较发现，连续低量施用生物炭能显著增加油菜产量，其中C2处理油菜5年平均产量最高，但不同生物炭用量间差异不显著。

图  1  施用生物炭对油菜产量的影响

不同小写字母表示处理间差异达5%显著水平，下同。

Figure  1.  Effect of biochar on rapeseed yield

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从2020年油菜产量构成来看（表3），生物炭对油菜单株角果数影响较大，而对角粒数和千粒重的影响较小。与CK处理相比，C1和C2处理显著提高了油菜单株角果数39.8%和45.2%；同时，C2处理显著增加了成熟期油菜株高11.1%。

表  3  施用生物炭对油菜产量构成的影响

Table  3.  Effects of biochar on yield components of rapeseed

处理 Treatment	株高 Plant height (cm)	单株角果数 Number of pods per plant	角粒数 Corner number	千粒重 Thousand-grain weight (g)	产量 Yield (kg hm−2)
CK	94.23 ± 3.6 b	141.10 ± 12.0 b	22.46 ± 1.7 a	4.04 ± 0.09 a	1211.87 ± 37.58 b
C1	93.54 ± 3.7 b	197.25 ± 11.7 a	25.01 ± 1.3 a	4.11 ± 0.09 a	1254.60 ± 76.01 b
C2	104.71 ± 2.8 a	204.83 ± 5.8 a	23.22 ± 1.9 a	4.08 ± 0.06 a	1457.86 ± 29.05 a

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2.2   施用生物炭对土壤理化性质的影响

由图2可知，与CK相比，C1和C2处理土壤pH分别提高了0.13和0.21个单位，土壤交换性Al³⁺含量显著降低0.69和0.87 cmol kg⁻¹，而对交换性H⁺含量和MBC无显著影响。同时，与CK相比，C1和C2处理增加了土壤有机质含量11.7%和18.1%。C1和C2处理土壤DOC含量相比CK处理均显著增加约2.3倍，但C1和C2处理间土壤DOC含量无显著差异。

图  2  施用生物炭对土壤理化性质的影响

Figure  2.  Effects of biochar on soil physicochemical properties

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2.3   施用生物炭对土壤DOC荧光组分变化特征的影响

各荧光区域的积分值占总积分值的比例如图3所示，不施生物炭（CK）和施用生物炭处理（C1、C2）土壤DOC中有机碳成分主要是类富里酸，约占30%以上，其次为类色氨酸蛋白质，约占20%以上，占比最少的为微生物代谢产物（约10%）。连续施用生物炭有利于增加DOC中类酪氨酸和类富里酸的占比，显著降低了微生物代谢产物的占比，但C1和C2处理间无显著差异。

图  3  施用生物炭对土壤DOC荧光组分变化特征的影响

Figure  3.  Effect of biochar on variation characteristics of soil DOC fluorescence components

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2.4   施用生物炭对土壤DOC荧光参数变化特征的影响

土壤DOC三维荧光光谱参数结果如图4所示。DOC荧光指数是衡量DOC来源及降解程度的指标，当FI ≤ 1.4时，DOC主要来源于外来输入，FI ≥ 1.9时DOC主要来源于土壤中微生物代谢产物。图4结果表明，土壤DOC的荧光指数介于1.43 ~ 1.60之间，说明土壤DOM来源兼具内外源特征，与CK相比，C1和C2处理FI降低了4.4% ~ 10.6%，施用生物炭后有逐渐从土壤自生源转为外源的趋势，土壤芳香性增强，腐殖化程度增大。腐殖化指数是表征DOC的腐殖化程度，施用生物炭后土壤DOC腐殖化程度有增强趋势（图4），增幅为1.2% ~ 5.1%，但未达显著水平。自生源指数表示DOC自生源强度，BIX大于1表明微生物活性强，自生源特征强，与CK相比，C1和C2处理BIX均显著降低，降幅为22.6%，说明施用生物炭后土壤DOC自生源特征逐渐减弱。与CK相比，C1和C2处理新鲜度指数（β∶α）略有降低，但对DOC的新鲜度指数无显著影响。

图  4  施用生物炭对土壤DOC荧光特征参数变化的影响

Figure  4.  Effects of biochar on changes of fluorescence characteristic parameters of soil DOC

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2.5   土壤DOC光谱特征与土壤性质的相互关系

将土壤类酪氨酸（Ⅰ）、类色氨酸（Ⅱ）、类富里酸（Ⅲ）、微生物代谢（Ⅳ）、类腐殖酸（Ⅴ）、荧光指数（FI）、腐殖化指数（HIX）、自生源指数（BIX）、新鲜度指数（β:α）与土壤pH、交换H ⁺ 、交换Al^{3 +} 、MBC、有机质和DOC进行相关性分析（图5）。结果表明，土壤pH与土壤DOC（R = 0.85，P < 0.01）呈显著正相关，而与交换性Al^{3 +} （R = −0.82，P < 0.01）、微生物代谢产物（Ⅳ，R = −0.69，P < 0.05）呈显著负相关。土壤交换性Al³⁺与土壤DOC（R = −0.84，P < 0.01）、MBC（R = −0.71，P < 0.05）、土壤类酪氨酸（Ⅰ，R = −0.70，P < 0.05）呈显著负相关，而与微生物代谢产物（Ⅳ，R = 0.68，P < 0.05）呈显著正相关。

图  5  土壤DOC组分变化特征、荧光参数变化特征与理化性质的相关性分析

图5中相关系数临界值R_0.05 = 0.67，R_0.01 = 0.80。Ⅰ：土壤类酪氨酸、Ⅱ：类色氨、Ⅲ：类富里酸、Ⅳ：微生物代谢、Ⅴ：类腐殖酸、FI：荧光指数、HIX：腐殖化指数、BIX：自生源指数、β:α：新鲜度指数、H⁺：交换性H⁺、Al³⁺：交换性Al³⁺、MBC：微生物量碳、TOM：有机质、DOC：可溶性碳，下同。

Figure  5.  Correlation analysis of components variation characteristics, fluorescence characteristic parameters in soil DOC and physicochemical properties

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为进一步探讨有机质、MBC、DOC及其光谱特征与土壤性质（pH、H⁺、Al³⁺）的相互关系，将土壤DOC及其光谱特征与相应环境因子进行冗余分析（RDA）。结果表明（图6），第一、二主成分贡献率分别为85.59%和10.67%。CK处理投射点分布在第一和第四象限，C1和C2处理投射点分布在第二和第三象限，说明不同处理土壤DOC及其光谱特征有较明显差异。同时，土壤pH（R² = 0.75，P < 0.05）和交换性H⁺（R² = 0.81，P < 0.01）是影响土壤DOC及其光谱特征变化的重要指标（图6）。

图  6  土壤DOC及光谱特征与土壤性质的冗余分析图

Figure  6.  Redundancy analysis (RDA) biplots representing relationships among soil DOC, spectral characteristics and soil properties

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3.   讨论

3.1   生物炭对油菜产量的影响

生物炭（2500 ~ 30000 kg hm⁻²）一次施用的增产、控酸、培肥、增碳等改良效果在旱地红壤已得到充分验证^{[24, 28]}。本研究中，与对照CK相比，低量生物炭（750 和1500 kg hm⁻²）施用下油菜当季产量增加了3.5%和20.3%，油菜单株角果数提高了39.8% ~ 45.2%，5年连续施用油菜产量平均显著增加8.7%和16.0%。这与董成等^[12]研究发现连续施用生物炭6年后可显著提高潮土农田玉米籽粒产量研究结果相似，由此说明旱地红壤较低用量的生物炭连续施用可以实现作物增产。张文峰等^[14]研究表明施用低剂量生物炭通过改善土壤理化性质和提高土壤肥力，进而有效增加红薯产量（18.0% ~ 23.7%）。纪立东等^[28]试验表明施用生物炭可以促进玉米和玉米根系的生长发育，其中适量生物炭（4500 kg hm⁻²）对玉米的增产效果最佳。试验中通过施用生物炭调节土壤酸性，增加土壤养分等是促进油菜产量增加的重要因素。

3.2   生物炭对土壤理化性质的影响

生物炭对酸性土壤中交换性Al³⁺的影响主要是通过调节土壤的pH实现的。连续施用碱性生物炭可以提高土壤pH，进而降低交换性Al³⁺含量^[29]。同时，生物炭作为富含碳的物质、具有较高的比表面积和疏松的结构^[8-9]，施入土壤能增加土壤有机碳含量，增加土壤养分含量，改善土壤容重、水分等土壤环境因子^[30]，生物炭还可影响土壤微生物活性和结构，从而改变土壤有机质的分解转化，有利于土壤DOC含量的增加，但不同生物炭用量对土壤有机碳累积转化的影响还存在差异^[31]。本研究中，与不施生物炭相比，两种生物炭用量（750 和1500 kg hm⁻²）连续施用5年后，均能提高土壤pH，降低交换性Al³⁺含量，增加土壤有机质和DOC含量，其中1500 kg hm⁻²处理土壤有机质含量和pH显著增加，而两种生物炭用量对土壤有机质和pH、交换性H⁺等理化性质的长期累积效应差异仍需进一步长期定位研究。

3.3   生物炭对土壤DOC荧光光谱特征的影响

本研究中土壤DOC组成以类富里酸和类色氨酸为主，生物炭的连续施入后增加了土壤DOC中类酪氨酸和类富里酸的比例。这与以往研究结果相似，生物炭施用后在微生物的作用下溶出部分DOC进入土壤，且生物炭溶出的DOC组分主要以类富里酸和类腐殖酸为主^[32]。土壤富里酸及类色氨酸类物质属于土壤中的易变组分，它们的增加能够促进土壤活性，有利于土壤养分活化能力的增强^[33]。Yu等^[34]研究也表明，有机物料施用能刺激微生物活性，促使土壤有机碳中蛋白质类物质向更加稳定的类富里酸等物质转化，因此生物炭处理中类酪氨酸和类富里酸含量的增加可能与土壤DOC中不同组分在一定条件下进行分解或合成转化有关^[34]。而类微生物代谢产物含量的降低可能是由于类富里酸物质较高的荧光强度掩蔽了类蛋白质与类溶解性微生物代谢产物的峰^[35]。同时，有机物料施用还能增加氧化还原酶、蔗糖酶等影响代谢产物周转酶的活性，加速微生物代谢产物的周转利用^[36]，可能是导致类微生物代谢产物含量降低的另一个原因，但具体原因还有待进一步研究。

荧光指数是表征DOC来源于微生物代谢还是外源输入的指标。连续施用生物炭后降低了土壤DOC荧光指数，说明施用生物炭后土壤DOC来源由自生源转为外源的趋势。新鲜度指数和自生源指数的降低也说明自生源特征逐渐减弱，土壤芳香性增强，腐殖化程度增大^[24]。这可能因为添加生物炭可促进微生物的活性，其分解能力增强进而加速外源碳的分解，导致土壤DOC中外源组分比例增加，荧光指数有所降低^[37]。较对照相比，生物炭处理的新鲜度指数降低了18.4%，说明生物炭的施用促进了DOC的利用，说明生物炭带来的营养物质可促进微生物降解有机质。张文浩等^[38]研究表明土壤DOC含量的增加可以明显促进溶解性有机碳腐殖化指数的增加，本试验表明施用生物炭后可以明显增加土壤中DOC含量。而土壤pH、碳、氮等养分以及土壤结构等因素直接或间接影响土壤DOC的分子量和芳香性的改变^[39]，生物炭施用直接影响有机碳矿化的同时，还通过影响土壤物理化学性质和生物活性进而间接影响DOC含量和组成。

4.   结论

综上所述，旱地红壤低量生物炭连续施用可以增加油菜产量，改良红壤酸度，增加土壤DOC含量，且更利于DOC中类富里酸物质的增加，增加土壤DOC的腐殖化系数，提高其稳定性，而秸秆半量炭化或全量炭化还田的经济成本和固碳增收差异及其影响因素还需要长期定位研究。