Spatial Distribution of Enzyme Activities in the Rhizosphere of Celosia argentea Linn. in Cd-contaminated Soil Using in-situ Soil Zymography
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摘要:目的
为探明土壤镉污染对超富集植物青葙根际酶活性空间分布特征的影响。
方法基于土壤酶谱技术，对镉污染土壤和非污染土壤中青葙根际β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶分布情况进行原位高分辨分析。
结果β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶活性较高的热点区域都集中在青葙根系分布的区域，且在根尖处浓度较高。在污染土壤和非污染土壤中，青葙根部中心位置β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性灰度值都显著高于距离根中心2 mm处酶活性灰度值。镉污染土壤青葙根部中心位置β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性灰度值相较于非污染土壤，分别降低了5%和3%。
结论青葙根际土壤酶活性的空间分布具有显著的异质性，与根系分布密切相关，且土壤镉污染显著抑制了β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶的活性。
Abstract:ObjectiveThe aim was to investigate the influence of soil cadmium (Cd) contamination on the spatial distribution of β-glucosidase and acid phosphatase in the rhizosphere of Cd hyperaccumulator Celosia argentea Linn.
MethodThe in-situ soil zymography was used to obtain the distribution of β-glucosidase and acid phosphatase in the rhizosphere of C. argentea in Cd-polluted soil and non-polluted soil.
ResultThe Results showed that the hot spots of β-glucosidase and acid phosphatase were along entire root of C. argentea, which were relatively higher at the root tips. In both the polluted and non-polluted soils, the grey value of β-glucosidase and acid phosphatase at the root center were significantly higher than those 2 mm away from the root center. In Cd-polluted soil, the grey value of β-glucosidase and acid phosphatase in the root center decreased by 5% and 3% when compared to that in the non-polluted soil.
ConclusionThe results showed that the spatial distribution of soil enzyme activities was closely related to the root distribution. Soil Cd contamination had a significant negative influence on the soil enzyme activities.
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【研究意义】植物修复技术（Phytoremediation）是一种低成本、低能耗、环境友好的原位修复技术，在重金属污染土壤修复领域极具应用潜力[1]。青葙（Celosia argentea Linn.）是本课题组在国内发现和报道的镉锰超富集植物，具有分布广泛、生长迅速、适应能力强、易于人工繁殖和一年多次收割等诸多优点，在土壤镉污染的植物修复领域表现出极高的应用前景[2−3]。近年来，本课题组以青葙为研究对象，围绕农艺调控、分子机制、根际效应等方向开展了一系列研究，并取得了一些成果[4−6]。为更好地将青葙应用于生产实践，仍需对其生理生化机制开展深入研究。【前人研究进展】土壤酶（soil enzyme）是土壤中具备生物催化功能的蛋白质类化合物，其活性是评价土壤健康状况的重要指标[7]。例如，在土壤碳循环中β-葡萄糖苷酶能将纤维素水解为葡萄糖，进而为植物提供碳源，而酸性磷酸酶在土壤磷循环中能促进磷酸盐的生成[8]。研究发现，土壤酶在土壤，尤其是植物根际土壤中的分布具有高度的异质性，即使在几厘米的微小区域内分布也并不均匀[9]。传统的非原位土壤酶活性检测方法（分光光度法、滴定法、荧光法等），往往采用破坏性取样方法，无法真实反映土壤酶活性的空间分布特征，具有较大的局限性[10]。近年来，土壤酶谱这一原位高分辨技术被引入土壤生态学领域后，在国内外受到了广泛的关注，为土壤酶活性研究提供了新的视角[11]。例如，Razavi等[12]通过土壤酶谱技术研究了植物根系对土壤酶活性空间分布的影响，发现亮氨酸氨基肽酶、酸性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶和纤维二糖水解酶在玉米根尖区域具有很高的活性，可能是由于根尖生成的根系分泌物促进了微生物活动。【本研究切入点】土壤镉污染通常会抑制土壤酶活性，进而影响土壤中碳氮磷循环，而植物根系能通过分泌有机酸、氨基酸、糖类等物质提高根际土壤酶活性，缓解重金属的毒害作用[13]。本课题组前期研究发现，利用青葙对矿区镉污染土壤进行为期一年半的田间修复实验后，土壤中磷酸酶等酶活性显著提高[6]。虽然国内外学者已针对土壤重金属与酶活性的关系开展了较多研究，但目前关于重金属对超富集植物根际酶活性空间分布特征影响的研究报道很少。通过土壤酶谱这一原位高分辨技术能实现根际微区环境中酶活性的二维可视化，为揭示植物修复过程中的根际效应提供原位和直观的表征手段。【拟解决的问题】本研究基于原位土壤酶谱技术，研究镉胁迫下超富集植物青葙根际与土壤碳循环和磷循环密切相关的β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶空间分布特征，以期为提高植物修复效率提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 供试植物
青葙种子取自桂林市阳朔县兴坪镇思的村铅锌矿尾砂库。选取颗粒饱满的种子，用10%的H2O2溶液浸泡消毒后，用蒸馏水冲洗并在育苗盘中播种培养，将育苗盘置于温室大棚中，保持白天平均温度25℃，夜间平均温度18℃，光照强度300 μmol photons m–2 s–1，日平均光照时间12 h，相对湿度70% ~ 75%。种子萌发后，每天固定时间浇水，待青葙幼苗长出4 ~ 6片嫩叶且植株高度超过4 cm时，移栽大小一致的幼苗到根箱进行试验。
1.2 供试土壤
供试土壤采自桂林市阳朔县兴坪镇思的村铅锌矿尾砂库污染农田0 ~ 20 cm表层（110°15′ E, 24°45′ N）以及污染农田附近未受到尾砂库污染的山坡荒地0 ~ 20 cm表层。将采集的土壤样品在阴凉处自然风干，去除树枝等杂物，磨碎过2 mm筛，用HNO3-H2O2 法消解，用电感耦合等离子体发射光谱仪（PerkinElmer Optima 7000 DV）测定土壤镉含量。土壤基本理化性质见表1。
表 1 供试土壤基本理化性质Table 1. The basic physicochemical properties of the soil in this study指标
Index非污染土壤
Non-polluted soil污染土壤
Polluted soilpH 5.82 ± 0.26 6.06 ± 0.19 有机质（g kg–1） 10.1 ± 1.12 15.3 ± 1.25 铵态氮（mg kg–1） 23.9 ± 2.65 16.0 ± 1.77 有效磷（mg kg–1） 5.85 ± 0.68 9.22 ± 1.25 速效钾（mg kg–1） 91.2 ± 9.60 145 ± 12.6 总镉（mg kg–1） 0.47 ± 0.08 4.90 ± 0.93 有效镉（mg kg–1） 0.06 ± 0.01 2.19 ± 0.25 1.3 试验设计
根箱试验于2022年4 ~ 6月于桂林理工大学重金属污染植物修复试验基地进行。准确称取1.0 kg的土壤，充分混匀后装于自制的根箱中（高15 cm × 长12 cm × 宽4 cm），根箱的一个侧面可以打开。选择大小一致的青葙幼苗移栽到根箱中，每个根箱1株，每个处理3个平行，每天固定时间浇水使水分含量保持一定范围，并将根箱种植青葙的一侧倾斜45°放置，4周后首先进行土壤酶谱实验，然后收取植物根、茎、叶，以及非根际土壤。
1.4 土壤酶谱操作程序和图像分析
通过优化Razavi等[12]的方案，将有机滤膜裁剪为符合根箱侧面青葙根系分布范围的大小（高10 cm × 12 cm），将底物4-甲基伞形酮（4-Methyl umbelliferone, MUF）溶解于10 mM的MES（C6H13NO4SNa0.5，pH = 6.5）缓冲溶液中，将有机滤膜浸泡在底物溶液中至饱和。将滤膜取出平整地贴在根际土壤界面上，使其紧密接触，避光1 h后剥离滤膜并小心地去除滤膜上的土壤颗粒。将滤膜转移到暗室中，使用平板光极设备进行拍摄，调整激发波长为355 nm，发射波长为460 nm，固定滤膜与紫外光源的距离，通过相机进行拍摄，底物在特定酶的水解下出现荧光（图1）。
根据底物的标准曲线量化酶谱图，即配制 MUF（0、0.01、0.2、0.4、0.6、1、4、6、8 mmol L–1）的梯度溶液，将4 cm × 4 cm 的滤膜浸泡其中，用与样品相同的方式拍摄，通过Matlab软件对图像进行处理，用单位面积滤膜吸收的MUF溶液量来计算酶活性大小。同时通过Matlab软件将图片转化为16度灰色图像，校正相机噪声，以空白样品的灰度值为背景值，将背景值从酶谱图中减掉后，再将灰度图像转换为彩色网状图片。
为了进一步定量研究青葙根系对土壤酶活性空间分布情况的影响，选取独立的侧根，以该根部中心点为中心，在垂直于根生长的方向上作垂线，提取垂线上距离根中心点2 mm左右距离内酶活性的灰度值，绘制距离根部中心不同距离酶活性的一维散点图。
1.5 青葙生物量和镉含量的测定
收获植物后，植物的株高和根长直接用尺子测量，随后用洁净的剪刀将其分为根、茎、叶3部分，用自来水反复冲洗，再用10 mM的EDTA溶液冲洗，将根、茎、叶在烘箱中70℃烘干至恒重后用电子天平测其生物量（干重）。烘干后的植物样品用HNO3 + HClO4（5∶3, v∶v）法消解，通过电感耦合等离子体发射光谱仪（Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer, ICP-OES）测根、茎、叶中的镉含量。所有试剂均为优级纯，采用国家标准参比物质（GBW10010）和平行空白样本进行质量控制，样品回收率在93% ~ 105%。
1.6 数据处理
用Matlab和Image J软件绘制酶谱图，用Origin软件绘制酶谱的一维分布图，用Excel 2016计算数据的平均值和标准偏差，用SPSS 18.0中的方差分析（ANOVA）和最小显著差数法（LSD）在P < 0.05水平下进行显著差异性分析。
2. 结果与分析
2.1 土壤镉污染对青葙生长的影响
表2为镉污染土壤中青葙生物量、株高和根长的变化情况。结果表明，与无污染对照组相比，镉污染对青葙地上部和根部的生物量没有显著影响。但镉污染使青葙的株高显著降低了18.2%，使根长显著增加了43.8%（P < 0.05）。
表 2 污染土壤和非污染土壤中青葙的生物量（干重）和株高土壤
Soil生物量（g）
Biomass （g）株高（cm）
Plant height （cm）根长（cm）
Root length （cm）地上部
Shoot根部
Root非污染土 1.56 ± 0.12 a 0.65 ± 0.08 a 18.95 ± 1.25 a 7.55 ± 0.84 b 污染土 1.41 ± 0.13 a 0.71 ± 0.11 a 15.50 ± 1.08 b 10.86 ± 1.13 a 注：不同小写字母表示同列不同土壤青葙生长数据差异显著，P < 0.05 2.2 青葙根、茎、叶中的镉含量
图2为污染土壤和非污染土壤中青葙根、茎、叶中的镉含量。结果表明，污染土壤中青葙根、茎、叶中的镉含量分别达到了55.69 ± 3.22、69.80 ± 4.57、94.9 ± 8.79 mg kg–1，显著高于无污染对照组。
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图 2 污染土壤和非污染土壤中青葙根、茎、叶中镉含量*表示数值间存在统计学上的显著差异（P < 0.05）Figure 2. The Cd concentrations in the roots, shoots, and leaves of Celosia argentea in polluted soil and non-polluted soil2.3 污染土壤和非污染土壤中青葙根际土壤酶活性空间分布
图3、图4为污染土壤和非污染土壤中青葙根际β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶活性的空间分布酶谱图，其中红色、黄色、绿色、蓝色表明酶活性从高到低。结果显示，两种酶活性的空间分布具有显著的异质性，在镉污染土壤和非污染土壤中，β-葡萄糖苷酶活性、酸性磷酸酶活性较高的热点区域都集中在青葙根系分布的区域，且在根尖处浓度较高。
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图 3 污染土壤和非污染土壤中β-葡萄糖苷酶活性灰度值分布情况Figure 3. The spatial distribution of the grey values of β-glucosidase in the polluted soil and non-polluted soil图5、图6为污染土壤和非污染土壤中距根部不同距离β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶活性分布散点图。结果表明，根际区域土壤酶活性显著高于非根际。对于β-葡萄糖苷酶，非污染土壤中青葙根部中心位置酶活性灰度值比距离根中心2 mm处酶活性灰度值高8% ~ 11%，镉污染土壤中根部中心位置酶活性灰度值比距离根中心2 mm处酶活性灰度值高4% ~ 7%。此外，镉污染土壤中，根部中心位置β-葡萄糖苷酶灰度值相较于非污染土壤，降低了5%。对于酸性磷酸酶，非污染土壤中根部中心位置酶活性灰度值比距离根中心2 mm处酶活性灰度值高4% ~ 5%，镉污染土壤中根部中心位置酶活性灰度值比距离根中心2 mm处酶活性灰度值高9% ~ 22%。镉污染土壤中酸性磷酸酶活性的平均灰度值相较于非污染土壤，降低了3%。
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图 4 污染土壤和非污染土壤中酸性磷酸酶活性灰度值分布情况Figure 4. The spatial distribution of the grey values of acid phosphatase in the polluted soil and non-polluted soil![]()
图 5 污染土壤和非污染土壤中距根部不同距离β-葡萄糖苷酶活性分布散点图Figure 5. The one-dimensional distributions of β-glucosidase at different distance from the roots in the polluted soil and non-polluted soil![]()
图 6 污染土壤和非污染土壤中距根部不同距离酸性磷酸酶活性分布散点图Figure 6. The one-dimensional distributions of acid phosphatase at different distance from the roots in the polluted soil and non-polluted soil3. 讨论
土壤酶是土壤中物质转化和元素循环的重要参与者与驱动者，对土壤理化性质的改变具有较高的敏感性[14]。因此，土壤酶活性不仅能反映土壤的健康状况，也可作为表征土壤重金属污染程度的敏感指标。本研究通过土壤酶谱这一原位高分辨技术，选取与土壤碳、磷循环密切相关的β-葡萄糖苷酶活性、酸性磷酸酶为研究对象，研究了镉污染土壤中超富集植物青葙根际酶活性的空间分布特征。本研究发现，青葙根际酶活性的热点区域与其根系的分布基本重合（图3、图5），这与前人的研究基本一致[15]。例如，Razavi等[12]发现玉米根际β-葡萄糖苷酶、纤维二水解酶、亮氨酸氨基肽酶和磷酸酶的活性分布与其根系的生长方向密切相关，且在根部顶端区域酶活性更高。Duan等[16]在铜污染土壤中，苜蓿根际酸性磷酸酶的活性在根尖区域达到最高，与本研究结果相似。姜振峰等[17]发现大豆根际β-葡萄糖苷酶活性与根系表型密切相关，延根系基部到根尖逐渐增加，在根尖区域达到最高。研究表明，植物根系分泌物中的酶能直接补充根际土壤酶含量，同时根系分泌物含有的碳、磷等营养物质能促进根际微生物活动和有机质的分解，更进一步提高了微生物对酶的分泌作用[18]。部分植物根尖位置根系分泌物的释放和渗出较根部其他位置更多，进而提高了该区域土壤酶活性。β-葡萄糖苷酶能通过水解葡萄糖苷键释放出葡萄糖，与土壤中与碳循环密切相关[19]。本研究发现，相较于非污染土壤，镉污染土壤中青葙根际β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶的活性受到了明显的抑制（图4、图6），这可能是土壤镉的毒性作用使土壤微生物的活性下降。李兴国等[20]发现土壤镉污染对土壤中放线菌活性、脲酶活性、酸性磷酸酶活性均有显著的抑制作用。一般认为重金属会引起蛋白质性质变化，与酶底物发生复杂化学反应，降低酶活性[21]。但也有研究发现，重金属胁迫下土壤酶活性相较于未污染土壤反而有所提高。例如，Duan等[22]通过土壤酶谱技术研究了土壤酶活性对重金属复合污染的响应，发现污染土壤中苜蓿根际β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性显著高于非污染对照组，这与本研究的结果不同。土壤酶活性对重金属胁迫的响应受到重金属毒性、酶自身特性以及土壤性质的影响，导致重金属与土壤酶活性之间的关系十分复杂，且重金属对土壤酶活性存在低剂量激活和高剂量抑制现象，这可能是实验结果不同的原因[23]。
本研究中，污染土的有机质、有效磷和速效钾含量显著高于非污染土壤（表1），这可能是土壤重金属污染之外，另一个影响β-葡萄糖苷酶活性、酸性磷酸酶活性变化的因素。高风等[24]研究了喀斯特地区不同植被恢复模式下土壤养分与酶活性之间的相互关系，发现土壤有机质、全氮、速效钾、速效氮和速效磷与土壤酶活性存在显著相关性，这些理化性质指标能通过改变土壤物质循环、能量流动和新陈代谢等影响土壤酶活性。当土壤中氮磷等营养成分含量较高时，能促进植物根系分泌更多的酶，并提供酶促反应底物，可能提高土壤酶活性[25]。我们的研究结果表明，虽然污染土的部分养分含量高于非污染土，但污染土壤中青葙根际β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶的活性仍显著低于非污染土壤，这说明与土壤养分潜在的促进作用相比，重金属污染对土壤酶活性的抑制作用占据了主导地位。
4. 结论
青葙根际β-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶活性的空间分布特征与根系密切相关，且在根尖区域较高，这可能是根尖位置根系分泌物释放较多导致的。土壤镉污染显著抑制了青葙根际β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶的活性。
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图 2 污染土壤和非污染土壤中青葙根、茎、叶中镉含量
*表示数值间存在统计学上的显著差异（P < 0.05）
Figure 2. The Cd concentrations in the roots, shoots, and leaves of Celosia argentea in polluted soil and non-polluted soil
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图 3 污染土壤和非污染土壤中β-葡萄糖苷酶活性灰度值分布情况
Figure 3. The spatial distribution of the grey values of β-glucosidase in the polluted soil and non-polluted soil
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图 4 污染土壤和非污染土壤中酸性磷酸酶活性灰度值分布情况
Figure 4. The spatial distribution of the grey values of acid phosphatase in the polluted soil and non-polluted soil
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图 5 污染土壤和非污染土壤中距根部不同距离β-葡萄糖苷酶活性分布散点图
Figure 5. The one-dimensional distributions of β-glucosidase at different distance from the roots in the polluted soil and non-polluted soil
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图 6 污染土壤和非污染土壤中距根部不同距离酸性磷酸酶活性分布散点图
Figure 6. The one-dimensional distributions of acid phosphatase at different distance from the roots in the polluted soil and non-polluted soil
表 1 供试土壤基本理化性质
Table 1 The basic physicochemical properties of the soil in this study
指标
Index非污染土壤
Non-polluted soil污染土壤
Polluted soilpH 5.82 ± 0.26 6.06 ± 0.19 有机质（g kg–1） 10.1 ± 1.12 15.3 ± 1.25 铵态氮（mg kg–1） 23.9 ± 2.65 16.0 ± 1.77 有效磷（mg kg–1） 5.85 ± 0.68 9.22 ± 1.25 速效钾（mg kg–1） 91.2 ± 9.60 145 ± 12.6 总镉（mg kg–1） 0.47 ± 0.08 4.90 ± 0.93 有效镉（mg kg–1） 0.06 ± 0.01 2.19 ± 0.25 
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表 2 污染土壤和非污染土壤中青葙的生物量（干重）和株高
土壤
Soil生物量（g）
Biomass （g）株高（cm）
Plant height （cm）根长（cm）
Root length （cm）地上部
Shoot根部
Root非污染土 1.56 ± 0.12 a 0.65 ± 0.08 a 18.95 ± 1.25 a 7.55 ± 0.84 b 污染土 1.41 ± 0.13 a 0.71 ± 0.11 a 15.50 ± 1.08 b 10.86 ± 1.13 a 注：不同小写字母表示同列不同土壤青葙生长数据差异显著，P < 0.05
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