Bacterial Community in Saline-alkali Soil after Application of Different Modified Materials Based on High-Throughput Absolute Quantification
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摘要:目的
采用高通量绝对定量方法探究改良物料对盐碱土壤细菌群落结构的影响，可弥补相对定量在研究盐碱土壤细菌群落变化方面的不足。
方法采用大田试验，以玉米为供试作物，设置对照（CK）、脱硫石膏（T1, 15 t hm−2）、土壤改良剂（T2, 15 t hm−2）、有机肥（T3, 7.5 t hm−2）、脱硫石膏（T4, 7.5 t hm−2 + 土壤改良剂7.5 t hm−2 + 有机肥3.75 t hm−2）5个处理，在玉米种植84天后利用高通量绝对定量技术测定土壤细菌绝对丰度、多样性和群落结构的变化。
结果施用改良物料可以降低土壤pH和盐分含量，其中，T4处理对降低pH的效果最显著，相比CK下降了0.44个单位（P < 0.05）。施用改良物料提高了土壤速效磷、速效钾、有机质和碱解氮含量，其中T4处理的速效磷、速效钾、有机质和碱解氮含量较CK分别提高59%、41.59%、25.44%和47.51%（P < 0.05）。绝对定量分析结果表明，变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、放线菌门和绿弯菌门是细菌优势菌门，施用改良物料增加了土壤细菌群落的丰富度和多样性，细菌16S rRNA基因拷贝数显著高于CK，且T4处理在增加细菌16S rRNA基因拷贝数方面好于其余改良处理。相关性分析结果表明土壤细菌优势类群（门水平和属水平）与速效磷、速效钾、有机质和碱解氮呈正相关或显著正相关，而与pH和盐分含量呈负相关。
结论施用改良物料降低了盐碱土壤pH和盐分含量，提高了土壤养分含量、细菌多样性和绝对数量。同时，引入高通量绝对定量方法开展研究能够弥补相对丰度在表征微生物群落方面的缺陷，因而在阐明微生态学许多悬而未决的问题具有一定潜力，可将这一技术引入土壤微生物群落的研究中。
Abstract:ObjectiveThe high-throughput absolute quantitative method was used to explore the effect of modified materials on the bacterial community structure of saline-alkali soil, which could make up for the deficiency of relative quantification in studying the changes of bacterial community in saline-alkali soil.
MethodA field experiment was conducted with maize as the test crop, five treatments were set up: CK (blank control), T1 (desulfurization gypsum 15 t hm−2), T2 (soil amendment 15 t hm−2), T3 (organic fertilizer 7.5 t hm−2) and T4 (desulfurization gypsum 7.5 t hm−2 + soil amendment 7.5 t hm−2 + organic fertilizer 3.75 t hm−2). After 84 days of maize planting, the absolute abundance, diversity and community structure of soil bacteria were determined by high-throughput absolute quantitative technique.
ResultThe application of modified materials could reduce soil pH and salt content. Among them, T4 treatment had the most significant effect on reducing pH, which was 0.44 units lower than CK (P < 0.05). The application of modified materials increased the contents of soil available phosphorus (AP), available potassium (AK), soil organic matter (SOM) and alkaline hydrolysis nitrogen (AN). The contents of AP, AK, SOM and AN in T4 treatment increased by 59%, 41.59%, 25.44% and 47.51%, respectively, compared with CK (P < 0.05). The results of absolute quantitative analysis showed that Proteobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Gemmatimonadetes, Actinobacteria and Chloroflexi were the dominant bacteria. The application of modified materials increased the richness and diversity of soil bacterial community. The copy number of bacterial 16S rRNA gene was significantly higher than that of CK, and T4 treatment was better than other modified treatments in increasing the copy number of bacterial 16S rRNA gene. The results of correlation analysis showed that the dominant groups of soil bacteria (phylum level and genus level) were positively or significantly positively correlated with AP, AK, SOM and AN, but negatively correlated with pH and salt content.
ConclusionThe application of modified materials reduced the pH and salt content of saline-alkali soil, and increased the soil nutrient content, bacterial diversity and absolute number. The introduction of high-throughput absolute quantitative methods to carry out research can make up for the defects of relative abundance in characterizing microbial communities. Therefore, it has certain potential in elucidating many outstanding problems in micro-ecology, and this technology can be introduced into the study of soil microbial communities.
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Keywords:
- Absolute quantification /
- Saline-alkali soil /
- Bacterial community /
- Reclaim /
- Hetao plain
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【研究意义】土壤微生物群落在维持土壤健康和生物多样性方面起着重要作用。盐碱土壤作为一种特殊的土壤类型，其微生物群落对指导盐碱土壤改良和提升土壤肥力具有重要影响。由于盐碱土壤复杂的物理化学特性以及微生物群落的高度多样性，准确、定量的描述微生物群落仍然是一个具有挑战性的任务。随着测序技术的发展，已经可以深入的研究微生物群落信息[1−2]。然而，常规的高通量测序仅能解析样本中的物种组成和其相对丰度信息，如果不考虑微生物载量的样品间变化，仅用相对丰度进行生物学解释可能是不全面的[3]。这是因为由于常规细菌16S扩增子测序每个样本之间对应的 reads 数量差距较大，为避免因样本数据大小不同而造成分析时的偏差，需对每个样本进行随机抽平处理，一般选择测序样本中最少reads数作为基数， 即将所有样本的reads数统一抽平到该值， 因此抽平处理使相对丰度分析忽略了不同样本之间总体微生物量存在的现实差异，造成了分析结果的偏差。例如，当两个样本都有20%的16S rRNA序列被分配到变形菌门时，通过这些信息仅能评估样本中变形菌门相对于其他细菌门的丰度，但相对定量并不能获得样本的细菌总数，如果第一个样本的细菌总数较高，那么该样本的变形菌数量要高于第二个样本的变形菌数量。因此，当预期样品总微生物生物量存在较大差异时，引入绝对定量的研究是至关重要的。绝对定量分析是计算样本每种微生物的拷贝数，从而实现绝对定量，因此通过绝对定量分析得到绝对丰度（即单位重量或单位体积下样本包含的微生物真实载量）能反映样本中每种微生物的真实数量和组间样本的真实差异。【前人研究进展】有研究人员在16S rRNA测序时通过添加一定量人工合成的内参标准序列来获得土壤微生物群落的绝对定量信息[4−6]。具体而言，就是在DNA提取过程中添加一定量的人工合成序列以对细菌丰度进行定量，该序列具有与自然界中微生物序列不相似的特征，从而避免了相似片段出现在样本中，使得计算和分析更加准确[7]。相比于传统的高通量测序方法，该方法是一种将qPCR绝对定量技术和常规高通量测序技术合二为一的技术，该技术不但可以进行Alpha多样性、群落组成、Beta多样性等常规扩增子测序分析，还可以获得样本细菌总数和特定菌种的绝对拷贝数。例如，Yang等[8]提出了一种改进的高通量绝对定量方法可以同时研究土壤细菌群落相对丰度和绝对丰度的变化特征；Wang等[9]利用高通量绝对定量方法研究了长期施氮下土壤掠食性粘细菌群落结构的变化情况，发现使用绝对定量技术得到的相对丰度和绝对丰度变化趋势不一致；Tkacz 等[10]的研究也有报道相对丰度变化不明显而绝对丰度变化明显的现象。这表明，在研究微生物群落的过程中引入绝对定量是非常重要的，缺少该指标将会导致对微生物群落的真实数量的误判[11]。内蒙古河套平原地处我国西北干旱内陆区，属于典型的大陆性气候区，但河套平原由于气候干旱和特殊的水文地质条件，土壤盐碱化严重[12]。据统计，目前河套平原盐碱地面积达32.3万hm2，占该区域总面积的45% [13]，严重制约了当地的农业可持续发展，因此，改良盐碱地刻不容缓。研究表明，脱硫石膏在改善土壤理化性质、增加土壤团聚、降低土壤pH和碱化度（Exchangeable Sodium Percentage, ESP）等方面具有显著的效果[14]；施用有机肥可提高土壤的总孔隙度、有机碳含量和土壤持水力，显著改善土壤环境质量，提高作物产量[15]；土壤改良剂能够降低盐碱土壤容重和电导率，增加土壤养分含量[16]。【本研究切入点】前人对于改良物料在盐碱地的研究主要集中在土壤理化性质及养分变化方面，而对土壤微生物群落响应改良物料的研究，尤其是基于高通量绝对定量方法研究不同改良物料对微生物群落的影响较少。【拟解决的问题】本文采用大田试验方法，探讨了施用脱硫石膏、土壤改良剂和有机肥对改善土壤理化性质的效果，并结合高通量绝对定量测序技术，揭示了土壤细菌群落对内蒙河套地区中度盐碱土施用改良物料的响应，以期从改善土壤理化性质和细菌群落的角度为施用改良物料改良河套地区盐碱土、提高土壤质量提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
试验地位于内蒙古包头市土默特右旗美岱召镇瓦窑村，属典型大陆性半干旱季风气候，年平均气温7.5℃，无霜期135 d左右，年平均日照3095 h，年平均降水量346 mm。本试验开展前表层（0 ~ 20 cm）土壤基础理化性质如下：pH为8.42，全盐含量为3.68 g kg–1，土壤有机质（SOM）为17.55 g kg–1，速效磷（AP）为11.88 mg kg–1，速效钾（AK）为64.67 mg kg–1，碱解氮（AN）为63.00 mg kg–1。
1.2 试验材料与设计
1.2.1 试验材料
供试玉米选用当地主栽品种弘丰556。脱硫石膏购自宁夏大武口电厂；牛粪有机肥购自当地农户；土壤改良剂购自宁夏丰源生物科技有限公司。本研究所使用的改良物料基本性质见表1。
表 1 本研究使用的改良物料参数Table 1. The modified material parameters used in this study参数
Parameter脱硫石膏
desulfurization
gypsum土壤改良剂
soil
amendment牛粪有机肥
Cow manure
organic fertilizer有机质含量 (%) − 45.00 40.00 速效氮含量 (%) 0.02 0.26 0.85 速效磷含量 (%) 0.03 0.33 1.38 速效钾含量 (%) 0.05 0.41 1.77 pH 6.88 8.00 8.12 含水率 (%) 10.00 12.15 28.36 微生物含量
(billion g−1)− 2.00 − 其他 − 糠醛渣、硝酸铵钙、
抗盐固氮菌− 1.2.2 试验设计
于2022年3 ~ 10月开展试验，采用单因素完全随机设计，设置对照（CK）、脱硫石膏（T1，15 t hm–2）、土壤改良剂（T2，15 t hm–2）、有机肥（T3，7.5 t hm–2）、脱硫石膏（T4，7.5 t hm–2 + 土壤改良剂7.5 t hm–2 + 有机肥3.75 t hm–2）5个处理。每个小区面积30 m2（5 m × 6 m），小区间用宽50 cm、高30 cm田埂隔开，每个处理3次重复，共15个小区，小区四周设置1 m宽的保护行。改良物料于2022年3月底一次性均匀施于土壤表面，用旋耕机均匀翻入耕层0 ~ 20 cm，并灌水1次，灌水量为300 m3 hm–2。玉米于2022年5月10日播种，9月21日收获，采用覆膜穴播，株距为30 cm，行距为50 cm，种之前施用尿素225 kg hm–2、过磷酸钙300 kg hm–2、硫酸钾60 kg hm–2，其他田间管理同当地现行管理措施。
1.2.3 样品采集
于玉米抽雄期（8月1日）在每个小区随机选取5点采集0 ~ 20 cm的表层土壤，去除杂物、细根，充分混合后分成两份，装入冰盒带回实验室。一份自然风干后用于测定土壤理化性质，另一份于−80℃储存，进行土壤DNA提取及高通量测序。
1.3 测定项目与方法
1.3.1 土壤基本理化性质测定
土壤pH按土水比1∶5浸提后，用PHS-3E型pH计测定；土壤盐分含量按土水质量比1∶5浸提后，用 DDS-11A型电导率仪测定电导率，土壤盐分含量根据Zhang等[17]的描述进行换算获得；土壤化学性质主要参考《土壤农化分析》进行测定[18]。土壤有机质采用重铬酸钾氧化外加热法测定；土壤碱解氮采用碱解扩散法测定；土壤速效磷采用NaHCO3浸提钼锑抗比色法测定；土壤速效钾用NH4OAc浸提火焰光度计法测定。
1.3.2 细菌绝对定量
使用TGuide S96磁珠法土壤DNA提取试剂盒提取土壤样品DNA。同时，利用TGrinder H24组织研磨均质仪（TIANGEN，OSE-TH-01）对土壤DNA进行混匀。将至少具有4种不同浓度（103、104、105和106个拷贝数）的9种不同尖峰序列添加到样品DNA库中。使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物对细菌16S rRNA基因的V3 ~ V4区进行扩增。一轮扩增体系10 µL，该反应含有1 µL样品DNA，1 µL指示内参，0.2 µL的NFW和KOD FX酶，5 µL的KOD buffer，2 µL的2mM dNTPs和0.6 µL的barcode引物对（10 μM）。二轮扩增体系20 µL，5 µL一轮PCR纯化产物，2.5 µL的MPPI-a和MPPI-b，10 µL的2 × Q5 HF MM。扩增程序：预变性步骤设置95℃、5 min；变性步骤设置95℃、30 s，退火步骤设置50℃、30 s，延伸步骤设置72℃、40 s，重复循环变性－退火－延伸3个步骤25次；末延伸步骤设置72℃、7 min。扩增得到的产物进行条带（琼脂糖凝胶电泳）检测和浓度测定，符合条件的样品进行混样。应用核酸纯化磁珠纯化扩增产物，之后使用PE250上机测序得到样本的原始文库。使用Illumina MiSeq平台处理16S rDNA 基因V3 ~ V4 可变区，在随后的分析中仅使用平均质量分数大于20、序列大于200 bp且没有模糊碱基判定的序列，对这些序列按照97%的序列相似性水平分成不同的操作分类单元（OTU），使用QIIME2软件的DADA2插件对数据进行质量过滤，降噪，拼接及去除嵌合体。然后使用Mothur1.25.1classify.seqs命令和RDP（http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）数据库对细菌OTU分类进行注释，并计算每个尖峰OTU的读数。根据Tkacz [10]所述，使用R建立读数与尖峰序列DNA拷贝数的标准曲线，标准曲线由尖峰序列DNA进行10倍稀释梯度制成，并利用尖峰 OTU 的读数计算样品OTU的绝对拷贝数。
1.4 数据分析
采用Microsoft Excel 2016软件进行数据统计分析。采用SPSS软件进行单因素方差分析，显著水平为0.05，采用邓肯法分析（P < 0.05）不同处理土壤理化性质及多样性指数之间的差异显著性。使用R的“vegan”包计算细菌α多样性指数并进行主坐标分析PCoA、Anosim和Adonis分析研究不同处理之间细菌群落的差异性。通过Canoco5软件进行土壤理化性质和细菌群落得冗余分析（RDA）。利用Origin软件绘制细菌群落相对丰度和绝对丰度柱状图。
2. 结果与分析
2.1 不同改良物料对土壤理化性质的影响
图1为施用改良物料后土壤理化性质的变化情况。与对照相比，施用改良物料显著提高了土壤速效磷、速效钾、有机质和碱解氮含量（P < 0.05），T4处理增幅效果最好，速效磷、速效钾、有机质和碱解氮含量较对照分别提高了59%、41.59%、25.44%和47.51%。与对照相比，施用改良物料降低了土壤pH，仅有T4处理达到显著差异，较对照下降了0.44个单位（P < 0.05）。施用改良物料降低了土壤全盐含量，但各处理间差异不显著。
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图 1 不同改良物料对土壤理化性质的影响Figure 1. Effects of different modified materials on soil physical and chemical properties2.2 不同改良物料对土壤细菌α多样性的影响
对不同处理下细菌群落α多样性分析表明（表2），施用改良物料可提高细菌群落的丰富度和多样性指数。与对照相比，T4处理显著增加了Chao1指数，增幅为18.12%；改良处理的Shannon指数较对照显著提升了1.41% ~ 2.36%（P < 0.05），此外，Simpson指数较对照显著降低了3.45% ~ 13.79%（P < 0.05）。以上结果说明，施用改良物料可以提高细菌群落的丰富度和多样性。各处理的细菌群落覆盖率均在99.97%以上，表明这些数据可以真实有效的反应样本环境的细菌多样性。
表 2 不同处理对土壤细菌α多样性的影响Table 2. Effects of different treatments on α diversity of soil bacterial diversity处理
TreatmentChao1指数
Chao1 indexShannon指数
Shannon indexSimpson指数
Simpson index覆盖度
CoverageCK 957.19 ± 70.66 b 9.10 ± 0.09 c 0.0029 ± 0.01 a 0.9998 T1 1057.25 ± 18.49 ab 9.23 ± 0.01 b 0.0027 ± 0.00 bc 0.9997 T2 1111.96 ± 55.81 ab 9.25 ± 0.02 ab 0.0028 ± 0.00 ab 0.9997 T3 1110.15 ± 62.43 ab 9.32 ± 0.09 a 0.0025 ± 0.00 c 0.9997 T4 1161.73 ± 38.90 a 9.32 ± 0.03 a 0.0025 ± 0.00 c 0.9997 注：数值为平均值 ± 标准误，不同小写字母表示处理之间的显著差异（P < 0.05）。 2.3 不同改良物料对土壤细菌群落的影响
从图2可以看出，施用改良物料使细菌总丰度从对照的5.80 × 108基因拷贝数/g干土增加到了改良处理的1.16 ~ 1.79 × 109基因拷贝数/g干土（P < 0.05），PCoA分析结果显示，第一轴和第二轴的贡献率分别为31.15%和 15.79%，累计贡献率为 46.94%，改良处理样点距对照较远，说明施用改良物料改变了土壤细菌的群落结构。
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图 2 不同处理土壤细菌丰度（a）和PCoA分析（b）Figure 2. Soil bacterial abundance (a) and PCoA Analysis (b) of different treatments在门水平上，共检测到44个菌门，其中有10个菌门的相对丰度大于1%，分别是变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、芽单胞菌门（芽单胞菌门）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、粘菌门（Myxococcota）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）和脱硫杆菌门（Desulfobacterota），图3为不同处理下10个菌门的相对丰度组成和绝对数量信息。整体而言，变形菌门（相对丰度38.80% ~ 42.89%）、酸杆菌门（相对丰度11.43% ~ 13.99%）和拟杆菌门（相对丰度11.22% ~ 13.60%）在所有处理中占有较大比例，其中，变形菌门是占比最大的一个门，在T4处理中相对丰度最高，为42.89%，且T4处理变形菌门绝对丰度为7.87 × 109基因拷贝数/g干土，显著高于对照的2.47 × 108基因拷贝数/g干土（P < 0.05）。T3处理变形菌门相对丰度较对照下降了5.51%，但绝对丰度从对照的2.47 × 108基因拷贝数/g干土显著增加到了5.18 × 108基因拷贝数/g干土，提高了40.49%（P < 0.05）。放线菌门的绝对丰度在T2处理中较对照显著增加了49.74%，但其相对丰度从对照的8.33%下降到了T2处理的7.31%，降幅为12.24%。
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图 3 土壤细菌优势门的相对丰度（a）和绝对丰度（b）比较Proteobacteria：变形菌门；Acidobacteriota：酸杆菌门；Bacteroidota：拟杆菌门；Gemmatimonadota：芽单胞菌门；Actinobacteriota：放线菌门；Chloroflexi：绿弯菌门； Firmicutes：厚壁菌门；Myxococcota：粘菌门；Nitrospirota：硝化螺旋菌门； Desulfobacterota：脱硫杆菌门。Figure 3. Comparison of relative abundance (a) and absolute abundance (b) of soil bacterial phylum属水平上的优势菌主要有溶杆菌属（Lysobacter）、鞘脂单胞菌属（Sphingomon）、藤黄单胞菌属（Luteimonas）、Subgroup_10，拟杆菌属（Pontibacter）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、亚硝化螺旋菌属（Nitrosospira）、P3OB_42、远洋杆菌属（Pelagibious）和盐坑微菌属（Salinimicrobium）等。其中，参与碳、氮循环的微生物有溶杆菌属、鞘脂单胞菌属、藤黄单胞菌属、拟杆菌属、硝化螺旋菌属和亚硝化螺旋菌属。如图4所示，与对照相比，改良处理降低了溶杆菌属（Lysobacter）的相对丰度，降幅为24.42% ~ 43.22%（P < 0.05），但其绝对丰度从对照的每克干土2.99 × 107基因拷贝数增加到了T4处理的4.97 × 107基因拷贝数；对于鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）来说，仅有T1处理的相对丰度高于对照，但其绝对丰度在所有改良处理中均显著高于对照（P < 0.05）；除T3处理外，其余改良处理均较对照显著提高了藤黄单胞菌属（Luteimonas）的绝对丰度（P < 0.05）；与对照相比，改良处理显著增加了远洋杆菌属（Pelagibious）的相对丰度和绝对丰度，增幅分别为45.35% ~ 52.07%和27.46% ~ 70.61%。
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图 4 土壤细菌属的相对丰度（a）和绝对丰度（b）比较Lysobacter：溶杆菌属； Sphingomonas：鞘脂单胞菌属；Luteimonas：藤黄单胞菌属；Pontibacter：拟杆菌属；Nitrospira：硝化螺旋菌属；Nitrosospira：亚硝化螺旋菌属；Pelagibius：远洋杆菌；Salinimicrobium：盐坑微菌；Subgroup_10，P3OB_42未找到中文名。Figure 4. Comparison of relative abundance (a) and absolute abundance (b) of soil bacterial genera2.4 土壤理化性质与细菌群落绝对丰度的相关性分析
基于门水平土壤细菌群落绝对丰度与土壤理化性质进行相关性分析（图5a）。结果表明，变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门与AP、AK、OM和AN呈显著正相关关系（P < 0.05），而与pH和盐分呈显著负相关关系（P < 0.05），说明土壤养分的提高能够促进优势细菌的生长繁殖。粘菌门与AK呈显著正相关关系（P < 0.05），与AP、OM和AN的相关性没有达到显著水平；硝化螺旋菌门、脱硫杆菌门与养分之间呈正相关关系，但没有达到显著水平；厚壁菌门与土壤养分、pH和盐分之间相关性不强。通过RDA分析了土壤理化性质与细菌属的关系，由图5b可知，第一轴和第二轴分别可以解释细菌属变异的72.23%和2.52%，前两轴共解释了74.75%的细菌属总变异，其中，pH和盐分与细菌呈负相关关系，AP、AK、OM和AN与细菌呈正相关关系。
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图 5 土壤理化性质与细菌门（a）和优势属（b）的相关性分析（a）中不同颜色、不同大小的椭圆表示相关系数的大小，椭圆倾斜方向表示相关系数的正负，数字表示相关系数，色柱表示相关性，蓝色表示负相关，红色表示正相关；（b）中Lysobact、Sphingom、Luteimon、Pontibac、Nitrosos、Nitrosp、Pelagibi、Salinimic、Subgroup，P3OB_42分别表示Lysobacter、Sphingomonas、Luteimonas、Pontibacter、Nitrosospira、Nitrospira、Pelagibius、Salinimicrobium、Subgroup_10和P3OB_42。SC：盐分；AN：碱解氮；AP：速效磷；AK：速效钾；OM：有机质。Figure 5. Correlation analysis between soil physicochemical properties and bacterial phylum (a) and dominant genera (b)3. 讨论
在本研究中，我们采用高通量绝对定量方法研究了不同改良物料施用对内蒙河套平原盐碱土壤细菌群落的影响。改良处理较对照显著增加了细菌16S rRNA基因拷贝数，说明施用改良物料后土壤细菌数量均显著增加。改良处理增加了细菌群落的多样性和丰富度，这主要是因为施用改良物料能够改善土壤结构，改善土壤通气透水性，同时为微生物提供丰富的代谢底物，减轻细菌之间的竞争，促进微生物的富集与增殖，使得土壤细菌多样性和丰富度增加[19]。
土壤细菌优势菌门为变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、放线菌门和绿弯菌门，与前人研究结果一致[20]。变形菌门是本研究中丰度最高的细菌，这可能是由于变形菌门在土壤碳、氮循环中起着重要的作用[21]，同时，T4处理的变形菌门丰度最高，与之对应的是AP，AK，SOM和AN含量的显著增加（图1），变形菌门与AP，AK，SOM和AN呈显著正相关也说明了这一点。放线菌门在分解难降解化合物中发挥作用[22]，也属富营养菌，但相对于变形菌门等竞争力强的微生物，它在营养丰富的土壤中竞争能力较弱[23]，故本研究中放线菌门的丰度较低。酸杆菌属于嗜酸性细菌，偏向于土壤 pH较低的环境[24]。前人对于酸杆菌丰度与土壤 pH之间的相关性进行了大量的研究，一些研究人员认为酸杆菌丰度与土壤pH呈正相关，而其他研究人员则持相反观点，可能原因是酸杆菌亚群或同一亚群中不同酸杆菌对土壤pH的反应不同。在我们的研究中，改良处理显著提高了酸杆菌的绝对数量，同时土壤pH也有所下降，这与Muneer等[25]的研究结果一致。厚壁菌门在促进碳循环方面具有重要作用[26]，T2处理较对照显著增加了厚壁菌门的丰度，这可能由于土壤改良剂中含有抗盐固氮菌，系厚壁菌门类。在属水平上，溶杆菌属（Lysobacter）、鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）、藤黄单胞菌属（Luteimonas）、拟杆菌属（Pontibacter）和亚硝化螺旋菌属（Nitrosospira）、远洋杆菌属（Pelagibious）的丰度在施用改良物料后增加[图4（b）]。其中，藤黄单胞菌属主要参与环境中碳和氮的循环[27]，这与化学性质分析有机质和碱解氮含量升高的结果一致；拟杆菌属能够分泌碳水化合物活性酶促进土壤碳代谢[28]，RDA分析的结果也表明拟杆菌属的丰度与有机质呈显著正相关；溶杆菌属（Lysobacter）主要参与固氮作用[29]，也是农业生产中的生防细菌。以上结果说明施用改良物料加快了土壤细菌代谢和养分转化效率，提升了土壤细菌群落的元素循环能力。
本研究发现，对细菌群落进行绝对丰度和相对丰度分析时，出现了与前人报道的绝对丰度和相对丰度研究结果相反的现象[30−32]。例如，基于相对定量的分析结果表明变形菌门的相对丰度在施用有机肥（T3处理）后降低，如果仅依此做结论，则会得出变形菌门的生长在施用有机肥后受到抑制。相比之下，绝对定量分析表明T3处理中变形菌门的丰度显著增加，这一结论也更符合施用有机肥后微生物的数量和丰度增加的常理；结合变形菌门是土壤营养丰富和高碳底物富集的表征，该门的微生物均为富营养型细菌[33]，主要对富含养分的易降解组分进行分解，丰富的碳基质需要更多的此类微生物参与降解。目前，越来越多的研究者发现在研究微生物群落过程中使用相对丰度存在较大的限制[34,35]。常规的高通量测序主要用于描述微生物群落的物种分类和相对丰度，忽略了样品间微生物总丰度的真实差异，这很可能会造成结果偏差[36]。例如，某一微生物相对丰度的增加并不一定是由其绝对丰度增加造成的，相反，造成这一现象的原因可能是其他微生物绝对丰度降低导致的[37]。绝对定量基于给定标准品的基因拷贝数，将所测量的基因拷贝数转换为实际微生物数量，不管该微生物在空间和时间上是上升、下降还是保持稳定[38]，都能获得准确地微生物信息，这与前人通过绝对定量方法研究不同样本间的微生物群落得出的结论一致[39−40]。这表明，在微生物群落研究中，绝对丰度可以更好地反映物种的真实数量以及不同样本之间微生物的总体变化情况[41]。
近年来，高通量测序的出现使微生物群落的研究变得更加便捷，但目前这一技术只能获取微生物群落的物种分类和相对丰度，不能提供群落中物种的绝对丰度数据[42]。因此，如果不考虑绝对定量，微生物群的潜在病理[43]、生理特性[44]和生态学意义[45]等可能会被它们的相对丰度所掩盖。绝对定量能够提供准确的微生物数量和组间样本的真实差异，有助于我们了解盐碱土壤改良过程中微生物群落的变化情况。本研究中引入的高通量绝对定量方法在获得绝对丰度的同时还能得到相对丰度的信息，因而在阐明微生态学许多悬而未决的问题上具有一定的潜力。因此，我们认为对微生物群落进行全面的生物学解释应同时考虑相对和绝对丰度，同时，在盐碱土壤改良过程中引入绝对定量分析微生物群落变化特征是十分必要的，这将有助于我们更好地理解微生物群落对盐碱土壤环境变化的响应和调控机制。
4. 结论
本研究通过引入高通量绝对定量技术探讨了施用脱硫石膏（15 t hm–2）、土壤改良剂（15 t hm–2）、有机肥（7.5 t hm–2）以及三者减量配施对盐碱土壤理化性质、细菌绝对丰度、多样性和群落结构的影响，得出以下结论：
（1）施用改良物料降低了土壤pH和盐分，提高了速效磷、速效钾、有机质和碱解氮含量，能够增加土壤细菌群落的丰富度、多样性以及优势细菌的绝对数量；土壤细菌优势菌门与土壤养分正相关，与pH和盐分含量负相关。
（2）高通量绝对定量技术能够获得绝对定量分析结果、常规相对定量结果以及相对定量和绝对定量的比较分析结果，能够提供准确的微生物绝对拷贝数和组间差异。引入高通量绝对定量技术能够弥补相对定量在研究微生物群落方面的缺陷，可将这一技术引入土壤微生物群落的研究中。
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图 1 不同改良物料对土壤理化性质的影响
Figure 1. Effects of different modified materials on soil physical and chemical properties
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图 2 不同处理土壤细菌丰度（a）和PCoA分析（b）
Figure 2. Soil bacterial abundance (a) and PCoA Analysis (b) of different treatments
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图 3 土壤细菌优势门的相对丰度（a）和绝对丰度（b）比较
Proteobacteria：变形菌门；Acidobacteriota：酸杆菌门；Bacteroidota：拟杆菌门；Gemmatimonadota：芽单胞菌门；Actinobacteriota：放线菌门；Chloroflexi：绿弯菌门； Firmicutes：厚壁菌门；Myxococcota：粘菌门；Nitrospirota：硝化螺旋菌门； Desulfobacterota：脱硫杆菌门。
Figure 3. Comparison of relative abundance (a) and absolute abundance (b) of soil bacterial phylum
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图 4 土壤细菌属的相对丰度（a）和绝对丰度（b）比较
Lysobacter：溶杆菌属； Sphingomonas：鞘脂单胞菌属；Luteimonas：藤黄单胞菌属；Pontibacter：拟杆菌属；Nitrospira：硝化螺旋菌属；Nitrosospira：亚硝化螺旋菌属；Pelagibius：远洋杆菌；Salinimicrobium：盐坑微菌；Subgroup_10，P3OB_42未找到中文名。
Figure 4. Comparison of relative abundance (a) and absolute abundance (b) of soil bacterial genera
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图 5 土壤理化性质与细菌门（a）和优势属（b）的相关性分析
（a）中不同颜色、不同大小的椭圆表示相关系数的大小，椭圆倾斜方向表示相关系数的正负，数字表示相关系数，色柱表示相关性，蓝色表示负相关，红色表示正相关；（b）中Lysobact、Sphingom、Luteimon、Pontibac、Nitrosos、Nitrosp、Pelagibi、Salinimic、Subgroup，P3OB_42分别表示Lysobacter、Sphingomonas、Luteimonas、Pontibacter、Nitrosospira、Nitrospira、Pelagibius、Salinimicrobium、Subgroup_10和P3OB_42。SC：盐分；AN：碱解氮；AP：速效磷；AK：速效钾；OM：有机质。
Figure 5. Correlation analysis between soil physicochemical properties and bacterial phylum (a) and dominant genera (b)
表 1 本研究使用的改良物料参数
Table 1 The modified material parameters used in this study
参数
Parameter脱硫石膏
desulfurization
gypsum土壤改良剂
soil
amendment牛粪有机肥
Cow manure
organic fertilizer有机质含量 (%) − 45.00 40.00 速效氮含量 (%) 0.02 0.26 0.85 速效磷含量 (%) 0.03 0.33 1.38 速效钾含量 (%) 0.05 0.41 1.77 pH 6.88 8.00 8.12 含水率 (%) 10.00 12.15 28.36 微生物含量
(billion g−1)− 2.00 − 其他 − 糠醛渣、硝酸铵钙、
抗盐固氮菌− 
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表 2 不同处理对土壤细菌α多样性的影响
Table 2 Effects of different treatments on α diversity of soil bacterial diversity
处理
TreatmentChao1指数
Chao1 indexShannon指数
Shannon indexSimpson指数
Simpson index覆盖度
CoverageCK 957.19 ± 70.66 b 9.10 ± 0.09 c 0.0029 ± 0.01 a 0.9998 T1 1057.25 ± 18.49 ab 9.23 ± 0.01 b 0.0027 ± 0.00 bc 0.9997 T2 1111.96 ± 55.81 ab 9.25 ± 0.02 ab 0.0028 ± 0.00 ab 0.9997 T3 1110.15 ± 62.43 ab 9.32 ± 0.09 a 0.0025 ± 0.00 c 0.9997 T4 1161.73 ± 38.90 a 9.32 ± 0.03 a 0.0025 ± 0.00 c 0.9997 注：数值为平均值 ± 标准误，不同小写字母表示处理之间的显著差异（P < 0.05）。
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